薛皓月,劉海龍,賈麗艷,郝璇,蘇艷玲,荊旭*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,太谷 030801;2.山西頤天泰檢測技術(shù)有限公司,臨汾 041000;3.山西海雅堂食品有限公司,榆次 030600;4.晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系,晉中 030619)

雙酚A、4-叔辛基苯酚和壬基酚等酚類內(nèi)分泌干擾物可用作增塑劑,以提高塑料產(chǎn)品(如微波爐飯盒、嬰兒奶瓶和飲水機(jī))的柔韌性、透明度和耐用性[1]。但這些酚類內(nèi)分泌干擾物可能會從廢棄的塑料材料中釋放出來并進(jìn)入到環(huán)境水體中,在水生生物中富集,進(jìn)入食物鏈,進(jìn)而危害人體健康[2]。體內(nèi)和體外試驗(yàn)已證明,這些化合物可以模仿雌激素,破壞人類的生殖、神經(jīng)、代謝、免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)[3],對人類產(chǎn)生負(fù)面影響;流行病學(xué)研究表明,接觸這些化合物是癌癥發(fā)病率增加和人類生殖健康下降的重要因素之一[4-5]。因此,迫切需要開發(fā)一種簡單、快速、準(zhǔn)確的分析方法來測定水產(chǎn)品中內(nèi)分泌干擾物的含量。

分散液液微萃取是高效的萃取和濃縮技術(shù),分散行為增加了兩相之間的接觸表面,實(shí)現(xiàn)了分析物的快速萃取[6]。該方法簡單、快速、高效,相比于固相萃取和液相萃取,消耗樣品和溶劑少,富集系數(shù)高[7-8],但是其在萃取過程中會使用有毒的萃取劑,并且萃取劑相難以收集[9]。為了克服這些缺點(diǎn),可使用綠色萃取溶劑來代替有毒溶劑以減少對環(huán)境的影響。

低共熔溶劑(DES)是一類由氫鍵供體和氫鍵受體依靠二者之間的氫鍵作用,按照一定化學(xué)計量比形成的兩組分或三組分低共熔混合物[10-11]。本工作擬開發(fā)一種由香葉醇和癸酸合成的新型的綠色DES,該溶劑具有易合成、低成本、低毒性以及高生物降解性的優(yōu)點(diǎn)[12-13]。大多數(shù)DES具有親水性,很難應(yīng)用于分散液液微萃取,而開發(fā)的新型綠色DES為疏水性,在從樣本中提取分析物方面具有廣泛的應(yīng)用前景。此外,開發(fā)的新型綠色DES密度小、凝固點(diǎn)低,提取并離心后,萃取物漂浮在離心管的上端,然后在冰浴中轉(zhuǎn)化為固相,將收集的萃取物在室溫下解凍,以用于隨后的儀器分析。作為綠色萃取劑的DES易于固化,可以大大減少萃取物收集的難度和收集過程中的潛在損失。

測定內(nèi)分泌干擾物的方法一般有熒光光譜法[14]、紫外分光光度法[15]、高效液相色譜法[16]和氣相色譜-質(zhì)譜法[17]等。其中,高效液相色譜法具有操作簡便、分析快速、成本低、易回收和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢。因此,本工作以香葉醇和癸酸合成的新型DES作為萃取劑,乙腈作為分散劑,結(jié)合水相形成三元混合體系,萃取富集水產(chǎn)品中的內(nèi)分泌干擾物(雙酚A、4-叔辛基苯酚和壬基酚),并采用高效液相色譜法進(jìn)行測定。方法簡單、快速、高效,適用于測定海參、鮑魚和草魚中內(nèi)分泌干擾物殘留量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀;DMT2500 型多管渦旋混合儀。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1 000 mg·L－1,分別準(zhǔn)確稱取雙酚A、4-叔辛基苯酚和壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度均為1 000 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確移取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度為100,10 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用10 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行隨后的試驗(yàn)。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:準(zhǔn)確移取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用甲醇逐級稀釋,配制成質(zhì)量濃度分別為2.5,5,10,25,50,100 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

雙酚A、4-叔辛基苯酚、壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品的純度均為99%,香葉醇、芳樟醇、癸酸、十一酸、十二酸和氯化鈉均為分析純;乙腈和甲醇為色譜純;海參、鮑魚和草魚樣品均購自當(dāng)?shù)睾ｕr市場。

1.2 色譜條件

Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5μm);柱溫20℃;流動相為體積比90∶10的甲醇-水的混合液;流量0.5 mL·min－1;進(jìn)樣量20μL;激發(fā)波長228 nm,發(fā)射波長305 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DES的制備

將癸酸和香葉醇在10 mL玻璃管中以2∶1的物質(zhì)的量之比混合,然后將混合物在80℃水浴鍋中加熱,直至形成穩(wěn)定的DES。冷卻后在室溫下儲存。

1.3.2 樣品預(yù)處理

稱取已粉碎的1 g水產(chǎn)品樣品于5 mL 離心管中,加入2 mL 乙腈,將離心管置于渦旋儀上,以轉(zhuǎn)速2 000 r·min－1渦旋振蕩3 min。取上清液400μL,經(jīng)0.45μm 濾膜過濾。

1.3.3 樣品測定

將100μL DES和400μL上述濾液混合,并迅速注入裝有5 mL 80 g·L－1氯化鈉溶液的10 mL離心管中,以完成DES的分散。將上述離心管以轉(zhuǎn)速3 500 r·min－1離心5 min,然后置于冰浴中進(jìn)行固化。將固化后所得樣品溶解于150μL甲醇中,按色譜條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照試驗(yàn)方法測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和草魚、海參、鮑魚等不同基質(zhì)的空白樣品溶液,所得色譜圖見圖1。由圖1可知:在優(yōu)化的色譜條件下,雙酚A、4-叔辛基苯酚和壬基酚可得到較好的分離;草魚、海參、鮑魚等不同基質(zhì)對樣品的分析亦無干擾。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和不同基質(zhì)的空白樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the mixed standard solution and the blank samples with different matrices

2.2 DES種類的優(yōu)化

試驗(yàn)以易合成、低成本、低毒性以及高生物降解性的DES作為萃取劑,使用癸酸、十一酸、十二酸分別與香葉醇、芳樟醇制備了不同種類的DES,在保持其他條件不變的情況下,考察了不同種類的DES對各內(nèi)分泌干擾物回收率的影響,結(jié)果見圖2。

由圖2可知,以癸酸和香葉醇制備的DES作為萃取劑時,各內(nèi)分泌干擾物的萃取回收率均較高?？赡苁且?yàn)檫@種DES氫鍵作用力強(qiáng),黏度低,流動性大,更易分散于溶液中,進(jìn)而提高了對目標(biāo)物的萃取效率。因此,最終選擇以癸酸和香葉醇制備的DES進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 DES種類對內(nèi)分泌干擾物回收率的影響Fig.2 Effect of types of DES on recovery of endocrine disrupting chemicals

2.3 萃取條件的優(yōu)化

以目標(biāo)化合物的平均萃取回收率為優(yōu)化指標(biāo),對DES組分的配比(A)、DES 體積(B)、乙腈體積(C)和氯化鈉用量(D)進(jìn)行四因素五水平正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)設(shè)計見表1,結(jié)果分析見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

由表2的極差分析可知,對內(nèi)分泌干擾物的萃取回收率影響由大到小依次為DES 組分的配比(A)、DES體積(B)、乙腈體積(C)、氯化鈉用量(D)。在萃取內(nèi)分泌干擾物過程中,DES組分的配比(A)是一個重要的變量,這可能會影響DES的黏度、密度和固化能力,從而影響萃取能力[18]。DES 體積(B)也是影響萃取回收率的重要因素之一,通常足量的萃取劑會提取更多分析物,以確保回收率和足夠的體積用于后續(xù)色譜分析。萃取劑用量應(yīng)該盡可能低,以實(shí)現(xiàn)高富集倍數(shù)和靈敏度,其次,分散劑的體積也會影響目標(biāo)物的萃取回收率,因此需要足夠的分散劑以確保DES均勻地分散在樣品溶液中,但是試驗(yàn)中過量的乙腈會影響目標(biāo)物的分配系數(shù)。向樣品中添加適量的氯化鈉會降低分析物在水中的溶解度,促進(jìn)分析物向有機(jī)溶劑的轉(zhuǎn)移,從而提高萃取效率;但是添加過量的氯化鈉會導(dǎo)致較大的靜電相互作用,削弱它們轉(zhuǎn)移至萃取相的能力,從而降低萃取回收率[10,19]。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the orthogonal experiment

綜合極差分析結(jié)果,內(nèi)分泌干擾物的最佳萃取條件組合是A2B2C2D3,即DES組分的配比(n癸酸∶n香葉醇)為2∶1,DES 體積為100μL,乙腈體積為400μL,氯化鈉用量為400 mg。按照A2B2C2D3的條件對內(nèi)分泌干擾物進(jìn)行萃取,經(jīng)過3次驗(yàn)證試驗(yàn)后,目標(biāo)物的平均萃取回收率為91.4%。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

按色譜條件測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以3種目標(biāo)內(nèi)分泌干擾物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,3種目標(biāo)內(nèi)分泌干擾物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.25～10μg·g－1內(nèi)與對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,具體的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 線性參數(shù)Tab.3 Linearity parameters

按3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),按10倍信噪比計算測定下限(10S/N),所得內(nèi)分泌干擾物的檢出限均為0.075μg·g－1,測定下限均為0.25μg·g－1。

2.5 精密度試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對海參、鮑魚、草魚等3種水產(chǎn)品空白加標(biāo)樣品進(jìn)行分析,每日平行測定5 次,共檢測5 d,計算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表4。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab.4 Results of test for precision(n=5)

由表4可知,日內(nèi)RSD 為0.72%～2.5%,日間RSD 為1.9%～3.8%。說明所建立的方法可獲得良好的精密度和重復(fù)性。

2.6 樣品分析及回收試驗(yàn)

為了考察該方法對于實(shí)際樣品的可行性,首先測定實(shí)際樣品海參、鮑魚和草魚中目標(biāo)內(nèi)分泌干擾物雙酚A、4-叔辛基苯酚和壬基酚的含量,平行測定5次,并進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。結(jié)果表明,實(shí)際樣品海參、鮑魚和草魚中目標(biāo)內(nèi)分泌干擾物雙酚A、4-叔辛基苯酚和壬基酚的含量均低于檢出限;計算回收率結(jié)果見表5。

表5 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of test for recovery

由表5可知:在海參、鮑魚和草魚中雙酚A 的回收率為78.8%～84.4%;在海參、鮑魚和草魚中4-叔辛基苯酚的回收率為79.1%～91.6%;在海參、鮑魚和草魚中壬基酚的回收率為78.7%～90.8%,表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和適用性。

本工作提出了一種基于新型DES的分散液液微萃取-懸浮固化-高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中內(nèi)分泌干擾物殘留量的方法。首次將香葉醇和癸酸以不同的比例合成新型的疏水性DES,可有效地從樣品溶液中提取內(nèi)分泌干擾物。DES在冰浴中固化,以促進(jìn)其從水溶液中分離,簡單且快速,利于萃取劑的收集。該方法簡單、高效、綠色,已成功應(yīng)用于測定海參、鮑魚和草魚樣品中的內(nèi)分泌干擾物的含量,并有可能在未來的研究中應(yīng)用于其他有害物質(zhì)的萃取和測定。