蔣兵 楊韜 封龍飛 王濤 蘇海翔，

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院/甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

自從Ashford和Porter［1］在1962年發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞中的“自食”現(xiàn)象以來，自噬的研究越來越受到研究人員的關(guān)注。直到2016年，諾貝爾醫(yī)學(xué)及生理學(xué)獎授予了一位日本學(xué)者Yoshinori Ohsumi，獎勵他通過酵母細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)了部分自噬的機制［2］，這進(jìn)一步激發(fā)了人們對自噬探索的熱情。研究發(fā)現(xiàn)，自噬其實是指細(xì)胞在受到某些刺激后，吞食損傷的細(xì)胞器，并通過膜包裹形成自噬小體，然后與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，最后通過自噬溶酶體內(nèi)部的酶完成對吞噬細(xì)胞器的降解過程。自噬產(chǎn)生的氨基酸和脂肪酸等降解產(chǎn)物可以傳輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中供細(xì)胞生長，殘基則被排出或被滯留在細(xì)胞質(zhì)中，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和細(xì)胞器的更新［3］。大量研究表明，自噬的發(fā)生與其相關(guān)自噬蛋白密切相關(guān)，其中Beclin-1基因、p62和LC3B蛋白已被證實是自噬的關(guān)鍵因子。Beclin-1基因主要通過與Ⅲ型PI3K形成復(fù)合體來調(diào)節(jié)其他Atg蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的定位，從而起到調(diào)節(jié)自噬活性的作用［4］。p62能夠結(jié)合泛素化修飾的待降解蛋白，通過與自噬膜泡分子上的LC3相互結(jié)合，將自噬降解底物招募至自噬泡中完成降解［5］。Atg7和Atg3等自噬相關(guān)分子可將LC3-I進(jìn)行泛素樣脂化偶聯(lián)系統(tǒng)的加工，使LC3-I以磷脂酰乙醇胺（PtdEth，PE）共價的形式插入到自噬小體的雙層膜中，使其轉(zhuǎn)化為LC3-II，而LC3-I與LC3-II的轉(zhuǎn)變又進(jìn)一步促進(jìn)了自噬小體的形成［6］。

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，越來越多的研究表明，很多中藥單體、提取物及衍生物對腫瘤細(xì)胞的自噬具有一定的影響。蔣君男等人［7］證實丹參中所含的丹參酮IIA可通過上調(diào)LC3-II/I、Beclin-1蛋白的表達(dá)，并下調(diào)p62蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞自噬。查勇等人［8］發(fā)現(xiàn)苦參中所含的苦參堿可通過升高WIPI1 mRNA表達(dá)水平，并上調(diào)Atg5、Beclin-1、LC3-II蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬。陳奇等人［9］發(fā)現(xiàn)紫草中所提取的紫草多糖可通過升高Atg5、Beclin-1 mRNA及LC3-II蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)H22肝癌細(xì)胞自噬。

紅景天又稱“金根”，是景天科的一種多年生草本植物，廣泛分布于嚴(yán)寒、干燥、缺氧、高海拔（3500～5000米）地區(qū)［10］。紅景天在亞洲的運用已有悠久的歷史，常被用作中草藥來治療疾病，如頭痛、癔癥和阿爾茲海默癥等［11］。在歐洲和北美，紅景天則被用作膳食補充劑來補充能量［12］?，F(xiàn)代藥理學(xué)的研究表明，紅景天中的提取物主要包括苯乙醇衍生物、單萜、三萜、黃酮類化合物和酚酸［13］。而紅景天苷（salidroside，Sal）是從紅景天根莖中所提取得到的主要有效成分之一。大量研究表明，紅景天苷具有廣泛的藥理學(xué)價值，如血管保護、神經(jīng)保護、抗氧化、抗炎等［14，15］，是一種頗具開發(fā)潛力的藥物成分。越來越多的研究表明，紅景天苷可影響不同類型癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡。然而，紅景天苷對腫瘤細(xì)胞的自噬作用及其潛在機制仍不清楚。本研究旨在探究紅景天苷對高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞（MHCC97-H highly metastatic human liver cancer cells，97H）自噬的影響，為后續(xù)進(jìn)一步探究其潛在機制提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 紅景天苷（純度99.56%）購自美國Selleck公司。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司。青霉素-鏈霉素購自上海BasalMedia公司。MDC染色試劑盒、高效RIPA裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒及SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。AO染色試劑購自美國Chroma Technology公司。總RNA提取試劑盒和mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。Beclin-1（1C10C4）和山羊抗兔二抗（SA00001-1）均購自美國Proteintech公司。p62（STX100685）、GAPDH（GT239）抗體購自美國GeneTex公司。LC3B（ab192890）購自英國Abcam公司。三色預(yù)染色蛋白標(biāo)記物（20351ES72）購自上海YEASEM公司。

1.2 主要儀器 透射電鏡（日本HITACHI公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；多功能實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌97H細(xì)胞購自上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞中心。將97H細(xì)胞用5mL完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+1%雙抗體+90%DMEM培養(yǎng)基）進(jìn)行培養(yǎng)，并置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。

1.4 透射電鏡觀察 將97H細(xì)胞用完全培養(yǎng)基（空白組）和80μM紅景天苷處理48h，將處理后的細(xì)胞收集在10mL離心管中，用PBS清洗細(xì)胞兩次。然后，用2.5%戊二醛室溫固定細(xì)胞90 min，用1%四氧化鋨固定細(xì)胞30min。用95%無水乙醇梯度脫水后，將細(xì)胞包埋，切片，用飽和醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色。最后，用透射電鏡觀察自噬囊泡、自噬小體和自噬溶酶體的形成，并進(jìn)行拍照。

1.5 MDC染色和AO染色 將對數(shù)生長期的97H細(xì)胞以5×104個/mL的密度接種在無菌的蓋玻片上，并置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日待細(xì)胞貼壁后，以不含藥物的完全培養(yǎng)基培育97H細(xì)胞作為空白組，以不同濃度紅景天苷處理97H細(xì)胞作為實驗組。處理48h后，用1Xwashingbuffer清洗細(xì)胞2次，分別用MDC和AO染色工作液室溫避光染色30min，再用1 X washingbuffer清洗3次。最后，將蓋玻片附著在載玻片上，并在蓋玻片上滴加collection buffer。通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.6 qRT-PCR 用終濃度為0μM（空白組）、20μM、40μM、80μM的紅景天苷分別處理97H細(xì)胞48h后，使用Trizol試劑提取總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄二步法合成cDNA，且每組樣品設(shè)置3個復(fù)孔。PCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司設(shè)計合成。反應(yīng)體系20μL，含SYBR Green PCR Master Mix 10μL，無酶水7.2μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL及cDNA模板2μL。PCR擴增過程如下：95℃預(yù)變性3 min；95℃10s、退火30s、72℃30s，共40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct方法進(jìn)行分析。所用引物序列和最佳退火溫度見表1。

表1 qRT-PCR引物序列和退火溫度

1.7 Western blot 將對數(shù)生長期的97H細(xì)胞以1×106的密度接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日待細(xì)胞貼壁后，用濃度為0μM、20μM、40μM和80μM的紅景天苷處理細(xì)胞。處理48h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白。采用免疫印跡法檢測Beclin-1、p62、LC3-I和LC3-II相關(guān)自噬蛋白的相對表達(dá)水平，并以GAPDH作為參照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用IBMSPSSStatistics22統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，檢測數(shù)據(jù)以平均±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自噬現(xiàn)象觀察 空白組中未發(fā)現(xiàn)自噬囊泡、自噬小體和自噬溶酶體，80μM紅景天苷處理的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了不同大?。?00～900nm）的自噬囊泡、自噬小體和自噬溶酶體。見圖1。為使自噬過程更加直觀，我們根據(jù)其結(jié)果制作了相應(yīng)的自噬流程圖。見圖2。

圖1 紅景天苷誘導(dǎo)97H細(xì)胞自噬（透射電鏡，×8000）

圖2 紅景天苷處理97H細(xì)胞后的自噬流程（透射電鏡，×8000）

2.2 紅景天苷誘導(dǎo)97H細(xì)胞自噬 與空白組相比，紅景天苷處理組中與自噬小體相關(guān)的綠色熒光數(shù)量呈劑量依賴性和時間依賴性的增加，且熒光亮度也隨之增強。見圖3。與空白組相比，紅景天苷處理組中與自噬溶酶體相關(guān)的紅黃色熒光數(shù)量呈劑量依賴性和時間依賴性的增加，且亮度也隨之增強。見圖4。

圖3 MDC染色檢測紅景天苷對97H細(xì)胞自噬的影響（熒光顯微鏡×200）

圖4 AO染色檢測紅景天苷對97H細(xì)胞自噬的影響（熒光顯微鏡×200）

2.3 紅景天苷對97H細(xì)胞中自噬相關(guān)基因mRNA水平的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白組相比，紅景天苷處理組可上調(diào)Beclin-1的相對mRNA水平（P＜0.05），同時，p62的相對mRNA水平與Beclin-1的相對mRNA水平呈負(fù)相關(guān)。見圖5。進(jìn)一步說明紅景天苷可以誘導(dǎo)97H細(xì)胞的自噬。

圖5 紅景天苷對97H細(xì)胞中Beclin-1、p62 mRNA表達(dá)水平的影響

2.4 紅景天苷對97H細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，紅景天苷處理組的LC3-II與LC3-I的比例呈劑量依賴性增加（P＜0.05）；同時，紅景天苷還能上調(diào)Beclin-1蛋白的相對表達(dá)水平，下調(diào)p62蛋白的相對表達(dá)水平（P<0.05）。見圖6。

圖6 紅景天苷對97H細(xì)胞中LC3-I、LC3-II、Beclin-1、p62蛋白表達(dá)的影響

3 討論

紅景天不僅可被用來治療一些疾?。?1］，還可以被用于膳食來補充能量［12］。紅景天苷是從紅景天根莖中提取得到的主要有效成分之一，越來越多的研究表明，紅景天苷不僅對血管和神經(jīng)起到保護作用［14，15］，同時還具有抗氧化和抗炎功能［16-17］。既往研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可影響乳腺癌［18］、胃癌［19］、結(jié)腸癌［20］、膀胱癌［21］等不同類型癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，但是否有誘導(dǎo)這些細(xì)胞自噬的作用及其作用機制尚不清楚。本研究選用了人肝癌97H細(xì)胞作為研究對象探究紅景天苷對其的自噬作用，并對機制進(jìn)行了初步探討。

自噬的形成可以概括為以下三個步驟：（1）細(xì)胞接收到自噬誘導(dǎo)信號后，在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生一個類似于“脂質(zhì)體”樣的膜結(jié)構(gòu)，該膜不斷膨脹，最終形成一個由兩個脂質(zhì)雙分子層組成的囊泡，可在透射電鏡下觀察到。（2）當(dāng)自噬囊泡持續(xù)延伸時，細(xì)胞質(zhì)中的所有成分都被細(xì)胞膜吸收，然后自噬囊泡閉合，成為一個封閉的球形自噬小體，可通過透射電鏡及相應(yīng)的染色方法觀察到。（3）自噬小體和溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，可借助透射電鏡及相應(yīng)的染色方法觀察到。在此期間，溶酶體中所含的酶會降解自噬小體的內(nèi)膜，并且兩者的內(nèi)容量被整合，自噬小體的含量也被降解，所形成的氨基酸、脂肪酸等降解產(chǎn)物被輸送到細(xì)胞質(zhì)中以獲得細(xì)胞生長所需的能量，殘基則被排出或被滯留在細(xì)胞質(zhì)中，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和細(xì)胞器的更新［3］。本研究通過透射電鏡觀察到紅景天苷可誘導(dǎo)97H細(xì)胞自噬的現(xiàn)象，通過MDC染色、AO染色檢測到97H細(xì)胞中的自噬小體及自噬溶酶體在胞質(zhì)中的分布。qRT-PCR和Western blot的結(jié)果表明，紅景天苷誘導(dǎo)97H細(xì)胞自噬的機制可能與上調(diào)Beclin-1 mRNA、下調(diào)p62 mRNA、增加LC3-II與LC3-I比例、上調(diào)Beclin-1蛋白水平、下調(diào)p62蛋白水平有關(guān)。

本研究以人肝癌97H細(xì)胞作為研究對象，運用透射電鏡、MDC染色、AO染色、qRT-PCR及Western blot研究了紅景天苷對其的自噬作用，并對機制進(jìn)行了初步探討。研究結(jié)果為紅景天苷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的研究提供了理論和實驗基礎(chǔ)，也為后續(xù)進(jìn)一步研究紅景天苷通過調(diào)控自噬來發(fā)揮抗肝癌效應(yīng)的相關(guān)分子機制提供了重要的實驗依據(jù)。