陳鑫沛，董 穎，楊浩鐸，王瑩瑩，王東營(yíng)，汪學(xué)德

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州450001)

冷壓初榨椰子油是于低溫條件下對(duì)新鮮椰子果肉進(jìn)行壓榨所得的植物油。高含量的中鏈脂肪酸使椰子油在機(jī)體中具有較低的脂肪轉(zhuǎn)化率；同時(shí)與傳統(tǒng)精煉椰子油相比，冷壓初榨椰子油在加工過程中沒有經(jīng)過高溫、脫色、脫臭等處理，減少了營(yíng)養(yǎng)成分與活性物質(zhì)的損失[1-3]。冷壓初榨椰子油在清除自由基、降低小鼠膽固醇與抗DNA氧化損傷等方面都具有功效[4-5]。

四氯化碳(CCl4)是一種可致肝損傷的化合物，被廣泛用于模擬人類肝臟在藥物作用下產(chǎn)生的急性損傷[6-8]?，F(xiàn)常用CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的動(dòng)物模型，特別是嚙齒動(dòng)物模型，研究植物提取物、黃酮類化合物、多糖和植物油等對(duì)急性肝損傷動(dòng)物模型的保護(hù)作用[9-10]?，F(xiàn)有研究表明，杏仁油、橄欖油、梔子油等皆具有緩解肝損傷的作用[11-13]。基于此，本文通過CCl4動(dòng)物模型探索冷壓初榨椰子油對(duì)小鼠急性肝損傷的抑制效果，旨在為其藥用研發(fā)提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種雄性小鼠(體重18～22 g)，由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(生產(chǎn)許可證SCXK(豫)2017-0001)，動(dòng)物房溫度20～25℃，濕度55%～75%，小鼠在實(shí)驗(yàn)前常規(guī)條件下飼養(yǎng)兩周。

1.1.2 主要試劑

椰子油(產(chǎn)于菲律賓)，京東商城；總膽固醇(TC)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒，南京建成生物有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸，北京協(xié)和藥廠；一級(jí)花生油，山東魯花集團(tuán)有限公司；色譜純正己烷、四氯化碳和其他分析純?cè)噭?，鄭州新豐實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.1.3 主要儀器

Flexstation3多功能酶標(biāo)儀、HM340E切片機(jī)，美國(guó)Thermo公司；PHX-150H光學(xué)顯微鏡，重慶光學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCl4肝損傷模型的建立

將72只昆明小鼠隨機(jī)分成6組，包括正常組、四氯化碳肝損傷模型組、聯(lián)苯雙酯組(150 mg/kg)、椰子油低劑量組(5 mL/kg)、椰子油中劑量組(10 mL/kg)、椰子油高劑量組(20 mL/kg)。正常組和四氯化碳肝損傷模型組給予小鼠10 mL/kg的生理鹽水，其他各組按照相應(yīng)的劑量進(jìn)行灌胃操作。在喂養(yǎng)期間，每隔3 d記錄小鼠的體重，每天監(jiān)測(cè)小鼠的攝食量與攝水量。連續(xù)喂養(yǎng)14 d后，除正常組外，其余各組分別于腹腔注射0.8%的CCl4(5 mL/kg，CCl4溶于花生油里)用于急性肝損傷建模。在注射完所有小鼠后，所有組都嚴(yán)格禁食16 h，期間正常供應(yīng)飲用水。

1.2.2 肝臟生化指標(biāo)的測(cè)定

從小鼠眼靜脈取血樣，放置2 h后離心，按試劑盒說明書檢測(cè)ALT、AST、LDH、TG、TC水平。通過頸脫位處死小鼠后立即解剖獲得肝臟。然后切除肝臟右葉的一部分并置于10%福爾馬林中，另一部分用生理鹽水制成10%的肝勻漿，離心，取上清液，按試劑盒說明書檢測(cè)GSH-Px、SOD活力及MDA含量。

1.2.3 肝臟組織學(xué)分析

將保存于福爾馬林中肝組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展開、HE染色后，使用光學(xué)顯微鏡(400×)進(jìn)行肝組織損傷程度的觀察。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，并采用GraphPad Prism 8繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷壓初榨椰子油對(duì)小鼠食量和體重的影響(見表1)

由表1可知：在攝水量方面，與正常組小鼠相比，椰子油低、中劑量組小鼠的攝水量顯著降低(P<0.05)，而其他各組小鼠的攝水量沒有顯著變化；在攝食量方面，與正常組小鼠相比，聯(lián)苯雙酯對(duì)小鼠的攝食量沒有顯著影響，而椰子油組小鼠的攝食量顯著減少(P<0.05)，且椰子油劑量越高，攝食量越少。這是因?yàn)橐佑椭杏薪?0%的中鏈脂肪酸甘三酯[14]，水解后直接轉(zhuǎn)化為中鏈脂肪酸從而增加小鼠的飽腹感，所以隨著小鼠攝入椰子油劑量的增加，其攝食量會(huì)相應(yīng)減少。同時(shí)，從體重變化上看，攝入椰子油對(duì)小鼠體重的增長(zhǎng)沒有消極影響。

表1 冷壓初榨椰子油對(duì)急性肝損傷小鼠食量與體重的影響

2.2 冷壓初榨椰子油對(duì)小鼠血清指標(biāo)的影響(見表2)

當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷后，細(xì)胞膜被破壞，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)通過肝細(xì)胞進(jìn)入到血液循環(huán)系統(tǒng)中，因此這3個(gè)指標(biāo)可用來反映肝損傷程度。由表2可知，正常組的血清中，AST、ALT、LDH 3種酶的活性都較為正常，分別為87.9、35.9、4 343.8 U/L。與正常組相比，CCl4組小鼠的肝細(xì)胞膜被CCl4損壞嚴(yán)重，3種酶活性都顯著提升(P<0.05)，表明小鼠肝損傷模型建立成功。服用保肝藥聯(lián)苯雙酯的小鼠其各項(xiàng)指標(biāo)雖然比正常組高出很多，但是相比CCl4組具有明顯的抑制作用(P<0.05)。同時(shí)，與CCl4組相比，不同劑量椰子油組小鼠的3種酶的活性也有所下降，而高劑量組最為顯著(P<0.05)，證明椰子油具有抑制肝細(xì)胞受損的作用。與ALT、AST、LDH 3種酶的情況相似，甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)在肝臟受到損傷后，濃度明顯增加(P<0.05)。與CCl4組相比，高劑量椰子油組小鼠血清中TG、TC的濃度顯著下降(P<0.05)。根據(jù)結(jié)果可知，高劑量的冷壓初榨椰子油可有效緩解因CCl4導(dǎo)致的急性肝損傷。

表2 冷壓初榨椰子油對(duì)急性肝損傷小鼠血清指標(biāo)的影響

2.3 冷壓初榨椰子油對(duì)小鼠肝組織SOD活力、GSH活力及MDA含量的影響(見圖1～圖3)

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)清除自由基的特異性酶，在平衡機(jī)體氧化與抗氧化中起到至關(guān)重要的作用；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是一種小分子肽，作為體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，其消耗程度也反映了肝損傷的程度；丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，通過其含量可反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度[15]。因此，通過測(cè)定肝勻漿中這3個(gè)生物指標(biāo)可以評(píng)價(jià)小鼠的肝細(xì)胞損傷程度。

由圖1～圖3可知，小鼠受到CCl4造成的急性肝損傷后，肝勻漿中的GSH-Px和SOD活力急劇降低(P<0.01)，MDA含量急劇增加(P<0.01)。聯(lián)苯雙酯組小鼠3種指標(biāo)的情況得到極顯著緩解(P<0.01)。同時(shí)，低、中、高劑量椰子油組小鼠的肝損傷情況得到不同程度的緩解(P<0.05或P<0.01)，其中高劑量椰子油對(duì)3種指標(biāo)的改善程度要優(yōu)于陽性對(duì)照聯(lián)苯雙酯。

注：*表示與CCl4組相比顯著差異(P<0.05)；**表示極顯著差異(P<0.01)。下同

圖2 椰子油對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織GSH-Px活力的影響

圖3 椰子油對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織MDA含量的影響

2.4 肝臟病理學(xué)檢查

圖4是光學(xué)顯微鏡下小鼠肝組織切片圖。

圖4 椰子油對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)的影響(400×)

由圖4可以看出：正常組小鼠的肝細(xì)胞完整，排列有序，細(xì)胞核圓且位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)保存完好；而CCl4組小鼠的肝臟呈現(xiàn)出血與纖維化現(xiàn)象，產(chǎn)生了空泡細(xì)胞與再生結(jié)節(jié)，并伴隨細(xì)胞萎縮或破裂；與CCl4組相比，聯(lián)苯雙酯組和椰子油組小鼠的肝損傷情況得到不同程度的改善，特別是高劑量椰子油組的保護(hù)效果比聯(lián)苯雙酯組更好，這與2.2和2.3結(jié)果相呼應(yīng)。由此可知，冷壓初榨椰子油的攝入對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。

3 結(jié) 論

對(duì)冷壓初榨椰子油進(jìn)行CCl4誘導(dǎo)肝損傷模型實(shí)驗(yàn)，從體重、肝生化指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可知，高劑量(20 mL/kg)椰子油能夠顯著抑制ALT、AST與LDH活性的增加，緩解TG與TC的上升，同時(shí)使SOD活力、MDA含量與GSH-Px活力恢復(fù)近正常值。從肝臟病理學(xué)檢查中也可看出，服用椰子油的小鼠肝臟切片細(xì)胞情況得到不同程度的改善。由此可知，冷壓初榨椰子油對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷有較好的保護(hù)作用，其中高劑量組(20 mL/kg)的效果甚至優(yōu)于陽性對(duì)照聯(lián)苯雙酯(150 mg/kg)。因此，冷壓初榨椰子油具有成為一款營(yíng)養(yǎng)健康的保肝護(hù)肝產(chǎn)品的潛力。