王謹涵，任曉霞，李曉琳，馬君義，陳麗萍，李茂星，邱建國

當人類從平原快速進入高海拔環(huán)境時，高原低氧、低壓、高輻射等特殊環(huán)境因素引起機體動脈血氧分壓和血氧飽和度降低，導致器官和組織缺氧，血管滲透性發(fā)生紊亂，致肺血管收縮和高血壓，驅動肺泡液體積聚，引發(fā)高原肺水腫(high altitude pulmonary edema，HAPE)[1-5]。HAPE是一種高風險病理生理改變，如果不及時診斷和治療，可能致命[6]。研究表明，在高原相關疾病中，缺氧和炎癥危害巨大[7-8]，二者往往同時發(fā)生，相互依存。一方面，缺氧引起的過氧化應激將導致炎癥反應的發(fā)生，影響器官功能，并伴隨一系列疾病的出現(xiàn)。另一方面，炎癥性疾病導致供氧不平衡進而使組織缺氧[9]。

目前，乙酰唑胺、紅景天等抗高原反應藥物具有很大的局限性。因此，高原特殊環(huán)境損傷防治藥物亟待開發(fā)。貫葉金絲桃因具有抗抑郁、抗菌作用而被廣泛應用于大眾醫(yī)學和植物療法中，同時也具有顯著的抗炎、抗缺氧等藥理活性[10]。金絲桃苷(HYP)和金絲桃素常作為其質量評價指標[11]。本研究采用大型低壓氧艙模擬海拔7500 m的高原環(huán)境，通過對大鼠肺組織病理切片的觀察及肺組織含水量、氧化應激指標、炎性因子的測定，研究貫葉金絲桃提取物(HPE)對HAPE大鼠的保護作用，以期為相關疾病的治療提供參考和實驗依據。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 貫葉金絲桃采自甘肅省康縣福祥中藥材種植農民專業(yè)合作社，經鑒定為貫葉金絲桃的干燥地上部分。貫葉金絲桃干燥地上部分粉碎后加8～10倍量70%乙醇于65 ℃回流提取3次，每次1 h，靜置，抽濾，合并3次濾液，減壓濃縮得濃度為49.11 g/L的上樣液。母液按樣品與樹脂的質量比為1∶15(g/g)緩慢、勻速地注入預先處理好的D101型大孔吸附樹脂柱(9.55 cm×85 cm)中，并以2.4 ml/min流速吸附26 h。然后分別用20%、95%乙醇以2.0 BV/h的流速洗脫至流出液為無色，收集95%乙醇洗脫液，40 ℃旋轉蒸發(fā)，濃縮液冷凍干燥后加入75倍量的乙酸乙酯，磁力攪拌下50 ℃加熱回流提取3次，每次1 h，靜置，抽濾，收集濾液，濃縮并冷凍干燥。將干燥后的藥粉再加入14倍量的乙酸乙酯，低溫靜置，濾紙過濾，濾餅干燥后得HPE，參照文獻[12]測得HYP含量為47.01%，金絲桃素含量為1.70%。整個提取分離過程避光操作。

HYP(純度>98%，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，批號：CX0012)；地塞米松片(DXM，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：200402)。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180412)；丙二醛(MDA，批號：A003-1-1)、過氧化氫(H2O2，批號：A064-1-1)、總超氧化物歧化酶(T-SOD，批號：A001-1-2)、還原型谷胱甘肽(GSH，批號：A006-1-1)和過氧化氫酶(CAT，批號：A007-1-1)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：20200602)、白細胞介素-1β(IL-1β，批號：SEKR-0002)、IL-6(批號：SEKR-0005)、血管內皮生長因子(VEGF，批號：SEKR-0032)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α，批號：SEKR-0009)測定試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2儀器 多功能動態(tài)熱回流提取濃縮機組(上海矩源設備有限公司，型號：JYT-50LN)；可調旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-52A)；冷凍干燥機(西班牙公司，型號：Telster LyoQuest-55 plus)；模擬高原低壓低氧動物實驗艙群(貴州風雷航空軍械有限責任公司，DYC-9070)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠，101-2-S)；全自動樣品快速研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，Tissuelyser-24)；制冰機(意大利斯科茨曼，AF-80)；Sigma 3K15高速冷凍離心機(德國Sigma公司，3K15)；全自動熒光酶標儀(美國Molecular 公司，SpectraMax i3)；水平搖床振蕩器(上海旌派儀器有限公司，TYZD-BS)；正置顯微鏡(甘肅嘉瑞貿易有限責任公司，BX40)。

1.3實驗動物 SPF級Wistar雄性大鼠80只，體質量180～220 g，購買于聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院動物實驗科，生產許可證號：SCXK(軍)2017-0023。動物飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院動物實驗科，使用許可證號：SYXK(軍)2017-0047。大鼠于恒溫(20～25 ℃)、恒濕(40%～50%)及12 h明暗交替條件下自由攝食進水。本研究經倫理委員會批準(2020KYLL064)。

1.4方法

1.4.1動物分組與模型制備[13]：80只SPF級Wistar雄性健康大鼠在動物實驗科適應飼養(yǎng)3 d后，隨機分為常氧空白組(NG組)，缺氧模型組(HG組)，貫葉金絲桃提取物低(HPE-L，100 mg/kg)、中(HPE-M，200 mg/kg)、高(HPE-H，400 mg/kg)劑量組，金絲桃苷低(HYP-L，50 mg/kg)、高(HYP-H，100 mg/kg)劑量組和DXM組(4 mg/kg)，每組10只。各組大鼠灌胃用藥均用0.5% CMC-Na助溶。5%苦味酸皮毛染色以標記大鼠。NG和HG組大鼠以0.5% CMC-Na(10 ml/kg)灌胃，其余6組按相應劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，第4天起除NG組外，其余各組均置于模擬海拔7500 m高原環(huán)境的模擬艙中飼養(yǎng)72 h。實驗人員每天上午8：30進入實驗艙后，將實驗艙以2 m/s勻速上升至海拔高度4000 m，同時模擬艙以10 m/s勻速下降至海拔高度4000 m，當兩艙體穩(wěn)定后，實驗者進入模擬艙，進行灌胃給藥，換食水和墊料。每次給藥后，模擬艙恢復海拔7500 m的高原環(huán)境，實驗艙恢復當?shù)睾０胃叨?。期間，動物自由攝食飲水，同時觀察大鼠生存狀態(tài)，末次給藥1 h后在實驗艙進行大鼠樣本取材。

1.4.2動物取材：各缺氧組大鼠缺氧72 h后，斷頭處死，打開胸腔，小心摘取完整肺組織并分為左肺和右肺，左肺上葉組織濾紙拭干殘血后用于肺含水量的測定，左肺下葉及右肺組織用預冷的生理鹽水沖洗殘血，濾紙拭干。左肺下葉組織低溫保存用于其他指標的測定，右肺組織浸泡于4%多聚甲醛中，用于HE染色。NG組同一時間按上述方法在常氧條件下取材。

1.4.3大鼠肺含水量測定：肺組織含水量檢測采用干濕比重法。將分離出的左肺上葉組織放入55 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中，直至干重稱量誤差在0.0 002 g內，根據公式：含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%，計算大鼠肺含水量。

1.4.4大鼠肺組織病理學觀察：大鼠完整右肺組織用4%多聚甲醛溶液室溫充分展開固定。固定好后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色(HE)，并于正置顯微鏡下放大200倍觀察肺組織病理學變化。

1.4.5大鼠肺組織勻漿液中氧化應激指標和炎性因子測定：取低溫保存的大鼠左肺下葉組織適量，加入9倍體積的預冷生理鹽水，用研磨儀充分勻漿，制成10%肺組織勻漿，并于4 ℃下4000 r/min離心15 min。BCA法測定肺組織勻漿液中蛋白質含量，根據各試劑盒說明書測定肺組織中MDA、GSH和H2O2的含量及T-SOD、CAT活力。應用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、VEGF和TNF-α含量。

2 結果

2.1肺含水量 NG組、HG組、HPE-L組、HPE-M組、HPE-H組、HYP-L組、HYP-H組和DXM組肺含水量分別為(47.22±0.04)%、(52.16±0.03)%、(49.25±0.03)%、(48.47±0.04)%、(47.41±0.04)%、(49.20±0.03)%、(48.28±0.08)%、(47.07±0.04)%。與NG組比較，HG組大鼠肺含水量升高(P<0.01)。與HG組比較，藥物組大鼠肺組織含水量降低，其中，HPE-M組、HPE-H組、HYP-L組及DXM組肺組織含水量顯著降低(P<0.01，P<0.05)。

2.2肺組織病理學觀察 NG組大鼠肺組織結構規(guī)則，肺泡腔清晰，無明顯水腫、炎癥等病理損傷。與NG組比較，HG組大鼠肺組織損傷明顯，結構完整性被破壞，肺泡壁明顯增厚，肺間質有充血、水腫現(xiàn)象。與HG組比較，HPE組、HYP組及DXM組肺組織病理結構改善，肺泡壁增厚減輕，肺泡腔擴張并趨于正常。其中HPE-M組、HPE-H組、HYP-L組、HYP-H組及DXM組肺組織結構改善較明顯，肺泡壁稍增厚，炎癥反應減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理學變化(HE×200)

2.3肺組織中MDA、H2O2、T-SOD、GSH和CAT水平 與NG組比較，HG組大鼠肺組織勻漿液中MDA和H2O2含量顯著升高，GSH含量及T-SOD、CAT活力顯著降低(P<0.01，P<0.05)。與HG組比較，HPE-M組、HPE-H組、HYP-L組、HYP-H組和DXM組大鼠肺組織勻漿液中MDA含量顯著下降，T-SOD活力顯著上升(P<0.01，P<0.05)；與HG組比較,HPE-M組、HYP-L組和HYP-H組大鼠肺組織勻漿液中H2O2含量顯著下降,HPE-H組、HYP-L組、HYP-H組和DXM組大鼠肺組織勻漿液中GSH含量顯著上升,HPE-M組、HPE-H組、HYP-H組和DXM組大鼠肺組織勻漿液中CAT活力升高(P<0.01，P<0.05)。見表1。

表1 貫葉金絲桃提取物對高原缺氧大鼠肺組織中氧化應激指標的影響

2.4肺組織中IL-1β、IL-6、VEGF和TNF-α水平 與NG組比較，HG組大鼠肺組織勻漿液中IL-1β和VEGF的含量顯著升高(P<0.01)。與HG組比較，HPE-L組、HPE-M組、HPE-H組、HYP-L組、HYP-H組和DXM組大鼠肺組織勻漿液中IL-1β和VEGF含量顯著降低(P<0.01,P<0.05)。與HG組比較，HPE-H組、HYP-L組、HYP-H組和DXM組IL-6含量顯著下降，HYP-H組和DXM組TNF-α含量顯著下降(P<0.01,P<0.05)。見表2。

表2 貫葉金絲桃提取物對缺氧大鼠肺組織中炎性因子的影響

3 討論

HAPE的易感性和發(fā)展與炎癥、缺氧有關。在一項隨機臨床試驗中發(fā)現(xiàn)，有HAPE病史的受試者在接受DXM治療時，表現(xiàn)出抵抗肺水腫發(fā)展的能力[14]。KUBO等[15]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α在早期HAPE中起作用，并可能與肺動脈高壓有關。炎癥反應中氧消耗增加，大量活性氧(ROS)中間體產生，局部營養(yǎng)物質耗竭，從而導致嚴重的組織缺氧[16]。ROS調節(jié)免疫因子的信號級聯(lián)通路，其水平升高可以促進炎性因子的產生，同樣，炎性因子的增加可以刺激自由基的產生。因此，在HAPE致病條件下，缺氧和炎癥有著密切的聯(lián)系[17]。

本研究結果顯示，缺氧72 h后，與NG組比較，HG組大鼠肺組織損傷明顯，肺泡壁增厚明顯，肺間質伴有充血、水腫，肺含水量明顯升高，說明HAPE模型建立成功。HPE與HYP灌胃給藥后發(fā)現(xiàn)，與HG組比較，藥物組大鼠肺含水量下降，其中，HPE-M組、HPE-H組、HYP-L組和DXM組下降最顯著。同時，藥物組大鼠肺組織結構得到顯著改善，肺泡壁增厚緩解，肺泡腔擴張并趨于正常，炎癥反應減輕，其中，HPE-M組、HPE-H組、HYP-L組、HYP-H組及DXM組改善較明顯。

ROS是一組不穩(wěn)定且具有高度活性的含氧分子，包括H2O2、超氧陰離子自由基(O2·-)和羥基自由基(·OH)。在氧化磷酸化過程中ROS由呼吸鏈以O2·-的形式不斷產生，O2·-通過SODs轉化為H2O2。相對于ROS的其他成員，非自由基的H2O2可以不受限制地通過細胞膜，并與亞鐵相互作用，產生具有高度破壞性的·OH[18]。MDA是膜損傷和機體衰老的重要指標，是由ROS增加而產生的有毒物質，其可以與生物大分子反應，改變細胞膜的流動性和通透性，最終改變細胞的結構和功能[19]。ROS過度產生導致氧化應激，會對細胞中的DNA、蛋白質和脂質造成損害，從而導致各種病理狀況[20-21]。CAT是一種抗氧化酶，防止H2O2的累積，將其分解為O2和H2O，并參與人類疾病的許多病理生理過程，對人體的生長發(fā)育和代謝活動具有重要的意義[22]。GSH參與機體內三羧酸循環(huán)及糖代謝，具有抗氧化作用和整合解毒作用，可保持機體正常的免疫系統(tǒng)功能[23]。SOD是直接清除自由基的酶，其以高特異性和高效率將超氧化物歧化為O2和H2O2，其在維持細胞健康方面發(fā)揮著重要的作用[24]。本研究結果表明，與NG組比較，HG組大鼠肺組織中MDA和H2O2含量升高，T-SOD、CAT活力及GSH含量下降，提示在7500 m模擬高原環(huán)境下，大鼠肺組織氧化還原平衡狀態(tài)被打破，受到氧化應激損傷。藥物干預后，缺氧大鼠肺組織中MDA和H2O2含量下降，T-SOD、CAT活力及GSH含量升高，提示HPE和HYP可有效改善HAPE大鼠肺組織氧化應激損傷。

在創(chuàng)傷中，體內發(fā)生感染，巨噬細胞被激活，產生并釋放大量的TNF-α，其可損傷血管內皮，破壞屏障功能，致毛細血管通透性增加，大量液體滲出，形成肺水腫。TNF-α可減少抗氧化劑的產生，降低機體清除氧自由基的能力，進一步加重組織損傷。IL-6是誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應的關鍵炎性因子，主要由T細胞、單核-巨噬細胞和內皮細胞分泌，可導致長期慢性炎癥。IL-1β是IL-1的一種亞型，是介導炎癥反應的重要細胞因子，具有廣泛的免疫調節(jié)作用。VEGF是機體內最強的血管通透性因子，可增加肺血管內皮細胞的通透性，加重HAPE，擴大機體的炎癥反應[25]。本研究結果顯示，HG組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α和VEGF含量較NG組升高，主要原因可能是缺氧后大鼠肺組織中大量ROS中間體產生，進而促進炎性因子的釋放，炎性因子的增加又刺激自由基的產生，調節(jié)氧化應激相關通路。藥物干預后，HPE和HYP各劑量組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α和VEGF的含量均下降，提示HPE的抗炎活性可能與下調HAPE大鼠肺組織中炎性因子的含量，恢復炎癥反應的平衡有關。

綜上所述，HPE能有效改善缺氧損傷大鼠高原肺水腫，保護大鼠肺組織免受氧化應激和炎性因子的損害。貫葉金絲桃有望開發(fā)成為治療HAPE的藥物制劑，其具體調節(jié)通路還有待進一步研究。