卓玉珍， 楊 磊， 鹿燕敏， 李棣華， 劉俊紅， 李彩霞， 崔立華， 鐘成梁

急性肺損傷(ALI)是一種嚴(yán)重的肺部炎癥性疾病，其病理機(jī)制復(fù)雜，是多種通路參與的炎性反應(yīng)過(guò)度激活引起的肺部疾病[1]。有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體參與ALI的病理過(guò)程，抑制其活化可以改善急性肺損傷[2-4]。此外，核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）和信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)也參與ALI的病理過(guò)程。涼血活血方適用于多種腹腔感染性疾病。本研究通過(guò)觀察其對(duì)膿毒癥ALI小鼠NLRP3炎性小體、NF-κB、STAT3等信號(hào)通路的影響，探索涼血活血方對(duì)ALI的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 72只雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量為20 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2014-0013。飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，光照時(shí)間為12 h/12 h明暗交替。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲食飲水，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)至少1周。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 涼血活血方由紅藤18 g，丹皮9 g，赤芍6 g，延胡索6 g組成，飲片購(gòu)自安國(guó)市普天和中藥飲片有限公司（執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2015年版一部）。參照《醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》，按人與小鼠之間的用藥劑量換算，小鼠的劑量（mg/kg）=W(動(dòng)物與人體的每公斤體質(zhì)量劑量折算系數(shù))×人的劑量(mg/kg)，查表得W=9.01，小鼠以20 g體質(zhì)量計(jì)算。水煎提?。猴嬈尤?0倍量的水，浸泡30 min，水沸后煎30 min，紗布粗濾取濾液；殘?jiān)?0倍量的水再煎煮30 min，過(guò)濾；合并兩次濾液，通過(guò)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，制成0.5 g/mL濃縮液。裝瓶密封放于4 ℃?zhèn)溆?。白?xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α炎性因子ELISA試劑盒購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司。髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。GAPDH、NF-κB、P-NF-κB、P-STAT3、STAT3、ASC和NLRP3抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，Caspase1 p20、IL-18、IL-1β購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀（上海科華實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)有限公司），垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)及全自動(dòng)多功能化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

1.2 方法

1.2.1 急性肺損傷模型制備、分組及給藥 將雄性的C57BL/6小鼠72只隨機(jī)均分為3組：假手術(shù)組、模型組和涼血活血方組。采用盲腸結(jié)扎穿孔法（cecal ligation and puncture, CLP）建立膿毒癥肺損傷的動(dòng)物模型。具體方法為：術(shù)前進(jìn)食不禁水12 h。麻醉備皮，下腹部正中切口，找到盲腸，在結(jié)腸根部和盲腸末端中點(diǎn)穿4.0編絲縫線，僅系盲腸，避免損傷盲腸動(dòng)脈；之后在盲腸末端和縫合線中點(diǎn)處，用21G針頭自系膜緣橫穿盲腸，撤針后擠出一小滴腸內(nèi)容物，還納盲腸，關(guān)腹。假手術(shù)組麻醉后僅開(kāi)腹翻動(dòng)盲腸。涼血活血方組灌胃給予涼血活血方水煎劑（6 g/kg）連續(xù)2 d（1次/d），第2次給藥2 h后開(kāi)始造模，模型組及假手術(shù)組給予同等體積生理鹽水灌胃。術(shù)后給予食水繼續(xù)飼養(yǎng)，24 h后麻醉取材。由于后期檢測(cè)標(biāo)本較多，實(shí)驗(yàn)分不同批次進(jìn)行。一批實(shí)驗(yàn)取肺泡灌洗，用于收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF)。一批實(shí)驗(yàn)取肺組織用于濕/干重比（W/D）檢測(cè)。最后一批實(shí)驗(yàn)，左側(cè)肺組織用于病理檢測(cè)，右側(cè)肺組織用于檢測(cè)MPO和相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.2.2 HE染色觀察肺組織病理改變 將肺葉固定于10%福爾馬林24 h后，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，采集圖像。肺組織損傷評(píng)分參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.3 小鼠肺組織W/D測(cè)量 取新鮮肺組織，稱量各組小鼠左肺重量，記為肺濕重，置于70 ℃烘箱烘烤約48 h至恒重，再次稱重記錄，記為肺干重。W/D=肺濕重/肺干重。

1.2.4 小鼠肺組織MPO含量檢測(cè) 取新鮮肺組織后，先進(jìn)行沖洗：將左心耳剪開(kāi)，用2.5 mL注射器抽取2 mL冰PBS，插入右心室進(jìn)行沖洗，肉眼可見(jiàn)肺臟顏色變白即可，沖洗結(jié)束，取肺組織按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行MPO測(cè)定。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)BALF中炎性因子含量 將小鼠麻醉后，頸部脫毛消毒，用眼科剪縱向剪開(kāi)頸部皮膚肌肉，充分暴露氣管，在氣管上切一倒置T型口進(jìn)行插管，用1 mL注射器向氣管內(nèi)緩慢注射預(yù)冷的PBS，洗2遍，每遍0.8 mL，每遍沖洗3次，回收液即為支氣管肺泡灌洗液。將灌洗液在1 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，取上清分裝于EP管中，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩０凑赵噭┖姓f(shuō)明書(shū)用ELISA法檢測(cè)上清TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.2.6 Western blotting 檢測(cè)肺組織NLRP3炎性小體、NF-κB、STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取-80 ℃保存的肺組織約35 mg，以1:10比例加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液(RIPA)，組織勻漿機(jī)冰上充分勻漿，充分裂解1 h后，4 ℃條件下以12 000 r/min離心15 min，取上清即為組織蛋白液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，最后加入上樣緩沖液，金屬浴加熱變性。肺組織上樣量每孔60 μg，經(jīng)SDS-PAGE膠分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗4 ℃過(guò)夜。第2天洗膜后加入二抗，2 h后洗膜，ECL顯色成像。蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察小鼠肺組織病理變化 HE染色發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的肺組織出現(xiàn)明顯的病理改變：肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔塌陷、融合或數(shù)目較少，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)水腫，毛細(xì)血管充血或出血，肺泡腔和肺間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。假手術(shù)組肺組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔清晰可見(jiàn)。與模型組相比，涼血活血方組肺組織病理改變明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)破壞減少，水腫減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)也減少。模型組肺組織損傷評(píng)分高于假手術(shù)組，涼血活血方組肺組織損傷評(píng)分高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化（HE，×100）

2.2 小鼠肺組織MPO含量的變化 與假手術(shù)組比較，模型組肺組織MPO的含量明顯升高，經(jīng)過(guò)涼血活血方治療后可以明顯降低其含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠肺組織MPO活性及W/D比值比較

2.3 小鼠肺組織的W/D比值變化 模型組小鼠肺組織W/D比值明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05），涼血活血方可以明顯降低肺組織W/D比值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 小 鼠 BALF中 TNF-α、IL-1β、IL-6含量的變化 造模24 h后，與假手術(shù)比較，模型組BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6均顯著升高（P＜0.05），經(jīng)過(guò)涼血活血方治療能夠明顯降低這些炎性細(xì)胞因子含量，減輕肺組織的炎癥損傷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠BALF中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量比較

2.5 小鼠肺組織NLRP3炎性小體、NF-κB、STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化 模型組小鼠肺組織中NF-κB、STAT3蛋白磷酸化水平高于假手術(shù)組（P＜0.05），而涼血活血方能夠明顯降低其磷酸化水平，抑制活化（P＜0.05）。另外，NLRP3炎性小體在膿毒癥肺損傷小鼠的肺組織中被激活，相關(guān)蛋白包括NLRP3、Caspase 1 P20、ASC、IL-18、IL-1β表達(dá)水平升高（P＜0.05），經(jīng)過(guò)涼血活血方治療后可以降低這些蛋白的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1 P20、IL-1β、IL-18、P-NF-κB和P-STAT3蛋白表達(dá)的變化

3 討論

膿毒癥是機(jī)體由于感染引起的免疫反應(yīng)，是重癥患者常見(jiàn)的并發(fā)癥[6]。ALI是膿毒癥最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，在中醫(yī)學(xué)里并沒(méi)有對(duì)應(yīng)的病名，但對(duì)其癥狀有相關(guān)的論述，并且認(rèn)為它病位在肺，可以累及全身器官。對(duì)于本病的發(fā)病機(jī)制，祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為是內(nèi)因與外因共同作用的結(jié)果。“熱”“毒”是它的發(fā)病基礎(chǔ)，毒邪犯肺又可導(dǎo)致“痰”“瘀”等病理產(chǎn)物，進(jìn)一步加重病情和加速疾病進(jìn)展[7]。在治療方面以涼血解毒、活血化瘀為主。涼血活血方全方四味藥，紅藤清熱解毒兼活血，為君藥；丹皮清熱涼血，瀉熱破瘀，為臣藥；赤芍涼血活血為佐藥，延胡索化瘀止痛為使藥。綜觀全方，可以清熱、解毒、散瘀。前期研究發(fā)現(xiàn)：涼血活血方可以改善膿毒癥大鼠腸屏障功能，降低血漿內(nèi)毒素水平，減少術(shù)后腸粘連，其有效組分還可促進(jìn)膿毒癥大鼠腸道血流及組織氧供的改善[8-10]。但其對(duì)膿毒癥肺損傷的作用和機(jī)制仍不清楚。本研究采用CLP制備ALI小鼠模型，觀察了涼血活血方對(duì)膿毒癥肺損傷小鼠的保護(hù)作用和可能的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，CLP建立的ALI模型24 h后小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變，肺組織水腫，中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)涼血活血方干預(yù)后，肺組織的病理?yè)p傷得到明顯改善；肺組織MPO活性降低，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少；肺的濕/干重比明顯降低，肺組織水腫減輕；由于各種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)各種炎性因子分泌增加，模型組BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性因子水平升高，涼血活血方可以明顯降低其水平，減少肺組織的炎癥損傷。這些研究結(jié)果可以說(shuō)明涼血活血方對(duì)膿毒癥肺損傷有明顯的保護(hù)作用，能夠減輕ALI的損傷程度。

炎性小體是機(jī)體應(yīng)對(duì)微生物入侵和破壞信號(hào)而形成的存在于細(xì)胞質(zhì)的大分子復(fù)合物[11]。NLRP3炎性小體作為研究比較廣泛的炎性小體，其核心蛋白NLRP3激活后招募接頭蛋白ASC，二者相互作用進(jìn)一步招募激活pro-Caspase-1，pro-Caspase-1誘導(dǎo)自身蛋白水解剪切為活化的Caspase-1。Caspase-1能夠引起促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18前體的成熟活化。隨后消皮素D（gasdermin D，GSDMD）導(dǎo)致細(xì)胞膜孔形成，細(xì)胞發(fā)生腫脹、裂解及死亡，同時(shí)IL-1β和IL-18大量釋放[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘發(fā)的ALI小鼠模型中，NLRP3炎性小體被激活，IL-1β和IL-18等炎性因子水平升高，通過(guò)抑制其活化可以明顯減輕肺組織損傷，增加小鼠存活時(shí)間，體外實(shí)驗(yàn)也可以觀察到同樣的現(xiàn)象[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)造模24 h后與對(duì)照組比較，模型組中NLRP3、ASC、Caspase-1 P20、IL-1β 和 IL-18表達(dá)明顯增加，肺組織損傷嚴(yán)重，給予涼血活血方后可以降低這些蛋白的表達(dá)，提示該方通過(guò)抑制NLRP3炎性小體活化從而減輕肺組織損傷。

NF-κB和STAT3是兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在膿毒癥ALI中有重要作用。NF-κB調(diào)控多種炎癥基因、生長(zhǎng)因子的表達(dá)，在多種炎癥疾病中發(fā)揮重要作用[16-17]。其被激活后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，引起下游基因轉(zhuǎn)錄增加，促進(jìn)炎性因子過(guò)度表達(dá)，加速肺損傷進(jìn)程。STAT3主要存在于胞漿中，是多種炎癥介質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)的途徑[18]，本研究前期也發(fā)現(xiàn)STAT3在ALI小鼠肺組織中被激活，磷酸化水平升高，抑制其活化可以減輕肺組織炎癥損傷[19]。本研究也觀察了涼血活血方對(duì)膿毒癥ALI小鼠肺組織NF-κB和STAT3蛋白的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)涼血活血方可以明顯抑制它們的活化，從而減輕小鼠肺組織炎癥損傷。

綜上所述，涼血活血方可以通過(guò)抑制NLRP3炎性小體激活和NF-κB、STAT3通路的活化，從而抑制下游相關(guān)炎性因子的釋放，減輕膿毒癥ALI肺組織炎癥反應(yīng)和損傷，這也許是涼血活血方防治膿毒癥ALI的作用機(jī)制之一。