楊 筱， 吳本升， 何宗琦， 楊建華

肛門直腸疾病的治療方法主要以手術(shù)治療為主，切口多為開放性創(chuàng)面，加之術(shù)后糞便刺激，導(dǎo)致切口變?yōu)槁愿腥緞?chuàng)面，愈合時間較長。江蘇省名老中醫(yī)黃禮主任中醫(yī)師將名方“生肌玉紅膏”進行化裁，結(jié)合其臨床經(jīng)驗和藥理學(xué)研究，依據(jù)“煨膿長肉”法，組成中藥復(fù)方制劑紫黃生肌膏，臨床觀察其具有良好的促進肛腸手術(shù)創(chuàng)面愈合效果[1]。前期實驗已證實紫黃生肌膏可以通過下調(diào)腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6抑制炎癥反應(yīng)，促進創(chuàng)面修復(fù)[2]。本實驗旨在通過建立慢性感染創(chuàng)面模型，應(yīng)用紫黃生肌膏治療，觀察創(chuàng)面新生毛細(xì)血管數(shù)量，檢測創(chuàng)面肉芽組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管生成素-1（Ang-1）的表達。VEGF和Ang-1都是促進血管生成的重要因子，它們不但能促進新生血管的生成，還具有促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的功能，本研究旨在觀察紫黃生肌膏對慢性感染創(chuàng)面血管生成的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 紫黃生肌膏：紫草15 g，大黃10 g，白芷15 g，甘草30 g，當(dāng)歸30 g，血竭12 g，珍珠粉6 g，白蠟60 g，麻油500 g。由蘇州市中醫(yī)醫(yī)院制劑室按藥物制劑規(guī)范加工成藥物油膏紗布。用時根據(jù)創(chuàng)面情況將紫黃生肌膏紗條剪成大小合適的紗條。貝復(fù)濟即重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子（rb-bFGF），國藥準(zhǔn)字S19991021（規(guī)格為63000 IU/15 mL/瓶），珠海億勝生物制藥有限公司生產(chǎn)，實驗全過程使用同批號藥物。糞液的制備：正常人新鮮糞便10 g，加生理鹽水5 mL，充分混均勻，離心機離心，取其上清液，每天現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗動物 雄性SD大鼠84只。上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(滬）2017-0005。

1.3 主要儀器及試劑 蘇木素-伊紅染液試劑盒（江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司，KGA224）；光學(xué)顯微鏡（Olympus，BX41）；臺式恒溫振蕩器（中國，上海精宏實驗設(shè)備有限公司，THZ-312）；Rat-VEGF（上海酶聯(lián)ml002862）；Rat-Ang-1（上海酶聯(lián)ml002916）。

1.4 模型制備 參照付小兵等[3]的造模方法，加以改進而形成綜合造模法，制作大鼠背部人糞污染慢性感染創(chuàng)面模型。將大鼠隨機分為4組，分別為空白組、模型組、貝復(fù)濟組、紫黃生肌膏組。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，備皮區(qū)用碘伏常規(guī)消毒，在脊柱兩側(cè)距脊柱2 cm處用直徑1.8 cm橡皮印章定位后切割直徑1.8 cm的圓形創(chuàng)面2個，創(chuàng)面深達肌層，肌層傷口厚度約0.3 cm，壓迫止血。充分止血后，空白組創(chuàng)面涂生理鹽水1 mL，其余3組在創(chuàng)面涂糞液約1 mL，以油紗、敷料、繃帶固定。實驗動物自由進水、覓食，48 h后去除覆蓋物，觀察創(chuàng)面見傷口有黃膿性分泌物，有糞臭味者為造模成功。

1.5 實驗分組 按照隨機數(shù)字表法將已編號的大鼠分成四組：空白組21只、模型組21只、貝復(fù)濟組21只和紫黃生肌膏組21只。

1.6 給藥方法 造模成功后第2天，按照組別及分組方案開始用藥，除空白組外，其余各組每天換藥前0.5 h在創(chuàng)面涂抹糞液1 mL，保持0.5 h后統(tǒng)一換藥，用藥前均常規(guī)清潔創(chuàng)面。空白組：不涂糞液，用生理鹽水清理創(chuàng)面；模型組：涂抹糞液，用生理鹽水清理創(chuàng)面；貝復(fù)濟組：涂抹糞液，用貝復(fù)濟（60 U/cm2）浸潤的紗布敷在創(chuàng)面上；紫黃生肌膏組：涂抹糞液，用紫黃生肌膏（0.2 g/cm2）浸潤的紗布敷在創(chuàng)面上。每組均每天換藥一次。

1.7 觀察指標(biāo) 各組大鼠在每次換藥前，觀察大鼠皮膚創(chuàng)面呈現(xiàn)的顏色、創(chuàng)面有無滲出物、水腫程度和肉芽組織生長情況等；分別記錄第3、7、14天各組大鼠創(chuàng)面大小，計算創(chuàng)面面積。用藥后第3、7、14天分批次隨機處死5只大鼠，取大鼠創(chuàng)面中心至創(chuàng)緣部分的肉芽組織，約0.5 cm×0.5 cm大小，常規(guī)石蠟切片處理。HE染色后觀察肉芽組織在光鏡下新生微血管的數(shù)量，取3個隨機視野里微血管數(shù)量的平均值，用ELISA法測定肉芽組織中VEGF、Ang-1的表達。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ）表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面觀察 84只大鼠造模48 h內(nèi)死亡4只，其中模型組死亡2只，貝復(fù)濟組和紫黃生肌膏組各死亡1只。空白組大鼠創(chuàng)面滲血、滲液少，肉芽組織生長旺盛，創(chuàng)面愈合速度最快。模型組大鼠創(chuàng)面滲血、滲液較多，每日換藥需清理較多分泌物，肉芽組織生長緩慢，創(chuàng)面凹陷，愈合速度最慢。貝復(fù)濟組、紫黃生肌膏組大鼠創(chuàng)面滲血、滲液較少，水腫消退較快，肉芽組織生長旺盛，創(chuàng)面愈合速度較快。見圖1。

圖1 各組大鼠用藥后第3、7、14天創(chuàng)面愈合情況

2.2 創(chuàng)面面積比較 用藥后第3天，模型組創(chuàng)面縮小慢于貝復(fù)濟組和紫黃生肌膏組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），第7和14天，紫黃生肌膏組創(chuàng)面縮小明顯加快，優(yōu)于貝復(fù)濟組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表 1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面面積比較

2.3 創(chuàng)面肉芽組織新生毛細(xì)血管數(shù)量比較 用藥后第3天，各組大鼠創(chuàng)面新生毛細(xì)血管數(shù)量較少，其中模型組與貝復(fù)濟組、紫黃生肌膏和正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；用藥后第7和14天，各組創(chuàng)面新生毛細(xì)血管增多，紫黃生肌膏組和貝復(fù)濟組新生毛細(xì)血管數(shù)量增長較模型組快，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其中紫黃生肌膏優(yōu)于貝復(fù)濟組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組創(chuàng)面肉芽組織新生毛細(xì)血管數(shù)量的比較

2.4 創(chuàng)面肉芽組織VEGF表達比較 用藥后第3天，模型組VEGF含量顯著低于紫黃生肌膏組及貝復(fù)濟組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；用藥后第7天，各組創(chuàng)面的VEGF均呈上升趨勢，紫黃生肌膏組高于貝復(fù)濟組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；用藥后第14天，各組創(chuàng)面的VEGF都下降，但紫黃生肌膏組創(chuàng)面VEGF含量仍高于貝復(fù)濟組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 各組創(chuàng)面肉芽組織VEGF表達的變化

2.5 創(chuàng)面肉芽組織Ang-1表達比較 用藥后第3天，紫黃生肌膏組及貝復(fù)濟組Ang-1含量顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；用藥后第7天，各組創(chuàng)面的Ang-1均呈上升趨勢，但模型組增勢較其余三組慢，紫黃生肌膏組高于貝復(fù)濟組及模型組（P＜0.01）；用藥后第14天，各組創(chuàng)面的Ang-1都下降，但紫黃生肌膏組創(chuàng)面Ang-1含量仍高于貝復(fù)濟組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表4。

表4 各組創(chuàng)面肉芽組織Ang-1表達的變化

3 討論

肛門直腸手術(shù)一般采用開放性創(chuàng)面，容易引發(fā)感染，從而減緩肉芽生長[4]，所以需重視術(shù)后創(chuàng)面的清潔換藥。此類慢性感染性創(chuàng)面愈合一般分為四期，分別為凝血期、炎癥期、修復(fù)期、成熟期。其中1～3 d天為凝血期，3～7 d為炎癥期，創(chuàng)面邊緣逐漸紅腫，創(chuàng)面滲出類似膿液的分泌物，此階段會發(fā)生一系列的反應(yīng)，如纖維蛋白溶解、炎性細(xì)胞浸潤、免疫應(yīng)答及復(fù)雜的血管反應(yīng)，從而清除創(chuàng)面上的壞死組織，為傷口修復(fù)和再生提供良好的條件；術(shù)后7～21 d為修復(fù)期，逐漸形成肉芽組織，其中成纖維細(xì)胞、新生血管、內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成肉芽組織的主要成分，并有部分上皮再生覆蓋創(chuàng)面[5]。

肉芽組織填充是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵，其中血管再生及血管網(wǎng)的形成有極其重要的作用，新生血管可以為創(chuàng)面細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣。缺氧可誘導(dǎo)早期血管生成細(xì)胞因子分泌，如VEGF是促進創(chuàng)面愈合的重要因素。VEGF可以通過促進炎性細(xì)胞進入損傷部位，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，從而促進血管生成。此外，VEGF還能改善傷口的再上皮化和膠原脫位[6]。有實驗研究發(fā)現(xiàn)，VEGF基因敲除小鼠缺乏血管內(nèi)皮分化和血管形成，導(dǎo)致胚胎死亡[7]。血管生成素是酪氨酸激酶受體Tie-2的配體，其中Ang-1是Tie-2的激動劑，通過Tie-2信號通路在血管生成和創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮重要作用。血管周細(xì)胞強烈表達Ang-1，并在皮膚創(chuàng)傷愈合后期向成熟的微血管募集，促進血管封閉和成熟[8]。缺乏Ang-1的小鼠由于產(chǎn)生滲漏的血管而早期死于出血[9]。VEGF和Ang-1有協(xié)同作用，有實驗發(fā)現(xiàn)同時使用VEGF、Ang-1的海綿，在第7天即形成新生血管結(jié)構(gòu)和血管平滑肌，并且新生血管密度保持穩(wěn)定，而使用單一因子的海綿中新生血管管徑小，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[10]。

本實驗通過觀察四組大鼠創(chuàng)面愈合情況，研究紫黃生肌膏對慢性感染性創(chuàng)面血管生成及血管內(nèi)皮生長因子和Ang-1表達的影響作用。紫黃生肌膏組大鼠創(chuàng)面在第7天就明顯小于模型組及貝復(fù)濟組。光鏡下可見第3天紫黃生肌膏組有較多新生血管生成，第7天創(chuàng)面有大量新生的毛細(xì)血管，血管內(nèi)徑較大，傷口周圍表皮細(xì)胞向傷口中心延伸蔓延，第14天僅有少量炎性細(xì)胞浸潤，肉芽組織已逐漸成熟為纖維結(jié)締組織，細(xì)胞間膠原纖維逐漸增多。同時VEGF、Ang-1在第3天就顯著增加，說明紫黃生肌膏啟動創(chuàng)面修復(fù)迅速，在第7、14天仍增長迅速，高于模型組和貝復(fù)濟組。結(jié)果提示紫黃生肌膏能夠有效上調(diào)VEGF、Ang-1的表達，促進創(chuàng)面新生血管形成，從而加速慢性感染性創(chuàng)面的修復(fù)。

對于慢性感染性創(chuàng)面，中醫(yī)稱之為“瘡瘍”，病機以瘀、虛為主，各種致病因素作用于局部，使氣血凝滯、經(jīng)絡(luò)阻塞，若不能及時內(nèi)消外解，則郁而化熱，熱盛肉腐，蒸釀成膿。《醫(yī)宗金鑒》有云：“謂腐不去則新肉不生，蓋以腐能浸淫好肉也；……若遇氣虛之人，則惟恃藥物以化之，蓋去腐之藥，乃瘍科之要藥也?！币鉃閷τ诟獠蝗?、新肉不生的創(chuàng)面，應(yīng)當(dāng)先使用去腐之品，使瘡瘍內(nèi)蓄之毒早日排出，腐去之后方可生肌[11]。江蘇省名老中醫(yī)黃禮主任中醫(yī)師根據(jù)《外科啟玄·明瘡瘍宜貼膏藥論》的“煨膿長肉”理論，將名方生肌玉紅膏化裁為紫黃生肌膏，去其毒性較強的輕粉，加入大黃和珍珠粉，更添解毒斂瘡之功。紫黃生肌膏方中大黃、紫草涼血解毒、清熱逐腐，可使創(chuàng)面氣血運行通暢，得以濡養(yǎng)充分，可有效促使創(chuàng)面“煨膿”，從而保持濕潤?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實大黃、紫草有抗菌、抗炎作用[12-13]，有研究證實大黃素能通過促進VEGF生成修復(fù)大鼠燙傷創(chuàng)面，并且與濃度相關(guān)。當(dāng)歸、血竭、白芷補血活血，化瘀止血，斂瘡生肌[14]。藥理學(xué)研究證實當(dāng)歸多糖能夠增加巨噬細(xì)胞吞噬能力[15]，并促進血小板聚集而止血[16]，血竭可以上調(diào)皮膚移植模型大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、表皮生長因子和羥脯氨酸的表達[17]，白芷可以通過下調(diào)FOXO1/Ang-2通路促進新生血管形成與成熟[18]。珍珠粉消腫止痛，結(jié)合甘草調(diào)和諸藥，攻補兼施。紫黃生肌膏涂于紗布條上，覆蓋慢性感染性創(chuàng)面，促使創(chuàng)面局部氣血通暢、濡養(yǎng)旺盛，有效改善局部血液供應(yīng)，保持旺盛的代謝修復(fù)狀態(tài)，促進傷口愈合，此法即為“煨膿長肉”。

朱朝軍等[19]提出慢性感染性創(chuàng)面煨膿長肉過程中的“藥瘡交互作用”，即煨膿長肉之品不但能夠促進創(chuàng)面VEGF等生長因子釋放，而且藥物作用于創(chuàng)面，促進分泌物生成，包含許多有效成分，例如Zn、Cu等，有效成分被創(chuàng)面活性細(xì)胞吸收利用，以補充創(chuàng)面局部營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏。受到物質(zhì)、能量補充的活性細(xì)胞會主動地釋放信號以主動攝取營養(yǎng)物質(zhì)，由被動變主動，促使更多藥物有效成分釋放，從而促進創(chuàng)面愈合。由此可見，紫黃生肌膏不僅能通過上調(diào)VEGF、Ang-1的表達，促進創(chuàng)面肉芽生長，還能改善創(chuàng)面微環(huán)境，使機體保持旺盛的代謝修復(fù)狀態(tài)。創(chuàng)面愈合過程復(fù)雜，仍需進一步探究紫黃生肌膏促進慢性感染性創(chuàng)面修復(fù)的作用機制。