李 冕 劉宣毅 董朝軍 東 彬

(河北省滄州市人民醫(yī)院骨4科，滄州市 061000，電子郵箱：13463476668@qq.com)

膝關(guān)節(jié)作為人體主要的負(fù)重關(guān)節(jié)，會(huì)因日常工作、生活而受到損傷，出現(xiàn)慢性損傷性病變，進(jìn)而發(fā)展為膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)。KOA是臨床上常見的關(guān)節(jié)疾病，主要以膝關(guān)節(jié)局部腫脹及關(guān)節(jié)疼痛為主要臨床表現(xiàn)。研究顯示，2018年我國(guó)KOA患病率為18%，其中女性患病率明顯高于男性[1]。除了高患病率，KOA還具有高致殘率、反復(fù)發(fā)作以及難以痊愈等臨床特點(diǎn)，如不及時(shí)給予有效的治療措施，患者極大可能會(huì)出現(xiàn)行走困難、癱瘓等后遺癥，日常生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響[2]。因此，明確KOA的發(fā)病機(jī)制從而給予針對(duì)性的干預(yù)，具有重要的意義。有研究顯示，各種細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與KOA的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[3-4]，而微小RNA(microRNA,miRNA)-29a及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)也與KOA發(fā)病相關(guān)，兩者在KOA患者滑膜和關(guān)節(jié)液中的水平呈負(fù)相關(guān)[5]。還有研究表明，KOA患者的疼痛和殘疾程度與血清干細(xì)胞生長(zhǎng)因子β(stem cell growth factor β,SCGF-β)表達(dá)顯著相關(guān)[6]。本研究分析KOA模型兔的miRNA-29a表達(dá)水平及其對(duì)SCGF-β、VEGF的表達(dá)水平及炎癥反應(yīng)的影響，旨在為今后相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4月齡無特定病原體級(jí)新西蘭兔48只，雌雄各半，體重(2 500.0±50.0)g，均購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK(冀)2008-0026]，飼養(yǎng)條件為雌雄分籠飼養(yǎng)，溫度20℃～25℃，濕度維持在45%～65%之間，飼養(yǎng)過程中保證充足的飼料、飲水，每天清理排泄物。本研究通過了動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理要求。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：抗SCGF-β抗體和抗VEGF抗體購(gòu)自上海研盟生物科技有限公司(批號(hào)：bs-0522r、98168127)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司(批號(hào)：10010-023、11684817910)，miRNA-29a模擬物、miRNA-29a陰性對(duì)照物和miRNA-29a抑制物均購(gòu)自上海吉瑪生物公司(批號(hào)：2020002、2020005、2020008)，RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(批號(hào)：FBS00219-1、nUC0153)；總RNA提取試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Invitrogen公司(批號(hào)：D1981、D1971、218161)；SCGF-β和VEGF檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司(批號(hào)：0708AFC34、DVE00)，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(批號(hào)：R2856c、310051)；miRNA-29a引物由上海達(dá)科為生物技術(shù)公司合成。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：H-600型透射電鏡購(gòu)自日本日立公司，ABI-7500型實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，BX50型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 KOA模型建立及鑒定：參照文獻(xiàn)[7]的造模方法，從雌、雄兩個(gè)整體中各選取20只兔子用于建立KOA模型，即KOA組(n=40)，其余兔子為空白對(duì)照組(n=8)，建模4周后，進(jìn)行干預(yù)及分組。將KOA組兔子固定于無菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，保持其后肢伸直，在右側(cè)膝關(guān)節(jié)處做一4 cm左右的縱向切口，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶以暴露關(guān)節(jié)腔，再依次切除內(nèi)側(cè)半月板及前、后交叉韌帶，對(duì)切口進(jìn)行清洗、縫合，用無菌敷料包扎后肢。術(shù)后給予兔子右側(cè)后肢肌內(nèi)注射40萬U青霉素進(jìn)行抗感染治療，1次/d，連續(xù)1周。術(shù)后每天驅(qū)趕兔子活動(dòng)30 min，飼養(yǎng)條件為溫度20℃～25℃，濕度維持在45%～65%之間，飼養(yǎng)過程中保證充足的飼料、飲水，每天清理排泄物；密切觀察兔子的右后肢情況，發(fā)現(xiàn)異常情況須及時(shí)進(jìn)行相關(guān)處理，例如出現(xiàn)切口紅腫等感染情況則要及時(shí)清潔傷口。建模4周后觀察兔子的活動(dòng)情況、關(guān)節(jié)軟骨表面變化情況，以及HE染色情況以評(píng)估KOA模型是否成功。評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)為：兔子右肢關(guān)節(jié)活動(dòng)明顯受限，關(guān)節(jié)軟骨表面可見凹陷，HE染色可見軟骨表層有裂隙、軟骨細(xì)胞層次不清晰、排列無序。

1.2.2 抗SCGF-β抗體、抗VEGF抗體干預(yù)：建模4周后，將KOA組兔子按隨機(jī)數(shù)字表法分為非干預(yù)組、SCGF-β組、VEGF組和SCGF-β+VEGF組，每組8只，其余8只進(jìn)行模型鑒定，每組雌雄各半。給予SCGF-β組兔子通過耳靜脈注射1 mL 10 μg/mL的抗SCGF-β抗體稀釋液+1 mL生理鹽水，給予VEGF組兔子通過耳靜脈注射1 mL 10 μg/mL的抗VEGF抗體稀釋液+1 mL生理鹽水，給予SCGF-β+VEGF組兔子通過耳靜脈注射1 mL 10 μg/mL 的抗SCGF-β抗體稀釋液+1 mL 10 μg/mL的抗VEGF抗體稀釋液，空白對(duì)照組與非干預(yù)組兔子通過耳靜脈注射2 mL生理鹽水，1次/d，共干預(yù)1周，干預(yù)1周后檢測(cè)兔血清炎性指標(biāo)水平。

1.2.3 KOA軟骨細(xì)胞的制備：干預(yù)1周完成采血后，采用耳靜脈空氣注射法處死非干預(yù)組兔子，以兔子右側(cè)股骨內(nèi)側(cè)為切口，分層切開組織，打開兔子膝關(guān)節(jié)腔，觀察關(guān)節(jié)液及關(guān)節(jié)軟骨面情況，并在無菌操作環(huán)境中摘取關(guān)節(jié)軟骨，剝離軟骨膜與筋膜后，取0.5 mm左右的軟骨組織碎塊，放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，采用含雙抗(青霉素濃度為100 U/mL，鏈霉素的濃度為0.1 mg/mL)的PBS沖洗組織3次，每次沖洗3 min；加入0.25%胰蛋白酶，37℃恒溫下進(jìn)行消化2 h，再加入0.02%Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫下進(jìn)行消化20 h。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；上海聯(lián)碩生物科技有限公司，批號(hào)：20201223)終止消化反應(yīng)，用200目濾網(wǎng)對(duì)吹打后過濾細(xì)胞，收集濾液，室溫(25℃)下3 500 r/min離心5 min后去除上清液，加入低糖(1.0 g/L)DMEM培養(yǎng)基重懸，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h后處理。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取上述制備的KOA軟骨細(xì)胞接種于六孔板中，細(xì)胞接種密度為2×105個(gè)/L，用含10%胎牛血清的DMEM在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，等細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)，按照Lipofectamine 2000說明書(上海恪敏生物科技有限公司，批號(hào)：20210819)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，隨機(jī)分為正常組、miRNA-29a模型組(Mimic組)、miRNA-29a陰性對(duì)照組(NC組)和miRNA-29a抑制組(Inhibitor組)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。正常組不予轉(zhuǎn)染。模型組用miRNA-29a模擬物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，NC組用miRNA-29a陰性對(duì)照物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，Inhibitor組將含miRNA-29a反向互補(bǔ)片段的抑制物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。將各組質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合物分別加入已標(biāo)記的對(duì)應(yīng)孔板中，輕搖使其均勻分布于孔板內(nèi)；再將細(xì)胞孵育6 h后換液，先用PBS清洗3次，保證清洗充分，再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，3 d進(jìn)行一次換液。

1.2.5 miRNA-29a相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)：干預(yù)1周后抽取各組兔子耳靜脈血2 mL，3 000 r/min離心10 min后取上清液。利用總RNA提取試劑盒提取各血清樣本和各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中的總RNA，在NanoDrop2000分光光度計(jì)(上海如海光電科技有限公司)上定量。取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，設(shè)置反應(yīng)條件為37℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃。配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系(寡核苷酸0.5 μL、4種dNTP 3 μL、Taq DNA聚合酶1 μL、靶系列DNA和PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL)，用U6作為內(nèi)參，用定量PCR儀進(jìn)行miRNA-29a相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)，設(shè)置反應(yīng)條件為95℃ 15 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-29a相對(duì)表達(dá)水平。miRNA-29a引物序列正義鏈為5′-GAGTTGACCACAGCACCTC-3′，反義鏈為5′-GAGACATCGTGGTAGACTTT-3′；U6引物序列正義鏈為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清SCGF-β、VEGF、TNF-α及CRP表達(dá)水平：干預(yù)1周后抽取各組兔子耳靜脈血1.5 mL，3 000 r/min離心10 min后取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分別檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)兔血清SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞SCGF-β和VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)水平：取各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，利用細(xì)胞裂解液(北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：Z808072)裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，使用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(上海生工生物有限公司，批號(hào)C503021)對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行定量，按比例加入4×蛋白上樣緩沖液，95℃變性5 min，置于-20℃保存?zhèn)溆?。設(shè)置濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印。取聚偏二氟乙烯膜用TBST洗膜5 min，共3 次，加入含2%牛血清白蛋白的TBS緩沖液配制的封閉液進(jìn)行封閉，室溫?fù)u床孵育2 h。 洗膜后加入一抗(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，批號(hào)：A91102205)(1 ∶200)4℃孵育過夜，再加入二抗(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，批號(hào)：A91205204)(1 ∶1 000)室溫下孵育1 h。將新鮮配制的化學(xué)發(fā)光試劑液滴加到聚偏二氟乙烯膜表面，轉(zhuǎn)移至成像分析系統(tǒng)暗箱中曝光，采集圖像并分析。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行分析，以相對(duì)灰度值代表蛋白相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞SCGF-β和VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平：取各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,用TRIzol法(美國(guó)Life technologies公司，批號(hào)：15596-303)提取總RNA，按照PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司，批號(hào)：11752050)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，設(shè)置實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系(10×擴(kuò)增緩沖液2.5 μL，4種dNTP混合物3 μL，引物1 μL，模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，Mg2+1.5 μL，三蒸水30 μL)，設(shè)置反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算SCGF-β 和VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 KOA模型鑒定結(jié)果 空白對(duì)照組兔子膝骨關(guān)節(jié)活動(dòng)自如，關(guān)節(jié)軟骨表面均勻光滑，HE染色顯示軟骨細(xì)胞分布均勻、排列整齊。KOA組兔子右肢關(guān)節(jié)活動(dòng)明顯受限，關(guān)節(jié)軟骨表面可見凹陷，HE染色顯示軟骨表層有裂隙、軟骨細(xì)胞層次不清晰、排列無序。見圖1。

圖1 兔子膝骨關(guān)節(jié)軟骨組織(HE染色，×200)

2.2 各組兔子血清指標(biāo)的比較 5組血清miRNA-29a、SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，與空白對(duì)照組相比，非干預(yù)組、SCGF-β組、VEGF組及SCGF-β+VEGF組的血清miRNA-29a相對(duì)表達(dá)水平均降低，而血清SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP水平均升高(均P<0.05)；與非干預(yù)組和VEGF組比較，SCGF-β組和SCGF-β+VEGF組血清SCGF-β表達(dá)水平均降低；與非干預(yù)組和SCGF-β組比較，VEGF組和SCGF-β+VEGF組血清VEGF表達(dá)水平均降低；與非干預(yù)組比較，SCGF-β組、VEGF組和SCGF-β+VEGF組血清TNF-α和CRP表達(dá)水平均降低(P<0.01)，且SCGF-β+VEGF組血清TNF-α和CRP表達(dá)水平均低于SCGF-β組和VEGF組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組兔子血清指標(biāo)的比較(x±s)

2.3 轉(zhuǎn)染后4組軟骨細(xì)胞miRNA-29a相對(duì)表達(dá)水平的比較 4組軟骨細(xì)胞的miRNA-29a相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，正常組及NC組miRNA-29a相對(duì)表達(dá)水平低于Mimic組，高于Inhibitor組；且Inhibitor組miRNA-29a相對(duì)表達(dá)水平低于Mimic組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組軟骨細(xì)胞miRNA-29a相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

2.4 轉(zhuǎn)染后3組軟骨細(xì)胞中SCGF-β、VEGF的蛋白及mRMA相對(duì)表達(dá)水平的比較 4組轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞SCGF-β、VEGF的蛋白及mRMA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。其中，3組轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞SCGF-β、VEGF的蛋白及mRMA相對(duì)表達(dá)水平均為Inhibitor組>NC組>Mimic組(均P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果

表3 各組軟骨細(xì)胞中SCGF-β、VEGF的蛋白及mRMA相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

由于受到倫理道德等因素的限制，往往在人體上不能直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，只能選用理想的動(dòng)物模型代替。動(dòng)物模型中對(duì)動(dòng)物的選擇直接關(guān)乎實(shí)驗(yàn)成敗，因此，選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)除了考慮是否容易控制、飼養(yǎng)、費(fèi)用、倫理等因素，同時(shí)也要兼顧動(dòng)物基因與人類基因的相似性以及疾病發(fā)病機(jī)制的相似性[8]。KOA模型的建模方法多種多樣，通過基因敲除、手術(shù)誘發(fā)、關(guān)節(jié)內(nèi)注射誘發(fā)等方法均可得到理想的KOA模型。兔子性格溫順，其膝關(guān)節(jié)面較鼠類大，關(guān)節(jié)內(nèi)操作方便，且關(guān)節(jié)的大體外觀與人相似，可用于實(shí)驗(yàn)的組織較多，而且既往研究提示采用前交叉韌帶橫斷法可成功建立KOA模型[9-11]。因此，本次實(shí)驗(yàn)研究選用新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用前交叉韌帶橫斷法建立KOA模型。本研究結(jié)果顯示，KOA組實(shí)驗(yàn)兔右肢關(guān)節(jié)活動(dòng)明顯受限，關(guān)節(jié)軟骨表面可見凹陷處，HE染色顯示軟骨表層有裂隙、軟骨細(xì)胞層次不清晰、排列無序，提示KOA模型建模成功。

miRNA廣泛分布于機(jī)體中，是非編碼短鏈RNA，通過互補(bǔ)靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)的堿基，使靶基因mRNA降解或翻譯受到抑制，從而調(diào)控相關(guān)靶蛋白的表達(dá)，在人體一系列病理生理進(jìn)展中發(fā)揮極其重要的作用[12]。研究表明，多種miRNA在KOA患者中表達(dá)異常。例如，血清miRNA-300表達(dá)水平隨KOA患者X線分級(jí)及Kellgren-Lawrence分級(jí)的增高而增加，可較好地反映出KOA的嚴(yán)重程度和軟骨損傷程度[13]；KOA患者滑膜中miRNA-140和miRNA-199的表達(dá)水平與KOA進(jìn)展相關(guān)[14]；miRNA-140-5p通過調(diào)控Toll樣受體4/髓樣分化因子88/核因子κB信號(hào)通路來保護(hù)KOA大鼠模型的滑膜[15]。miRNA-29a作為miRNA成員之一，廣泛參與甲狀腺乳頭狀癌、腸癌、肝纖維化等多種疾病的病理生理過程[16-18]。此外，miRNA-29可通過抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[19]，同時(shí)可靶向B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)蛋白X以調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示，非干預(yù)組兔子血清miRNA-29的表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)，提示miRNA-29表達(dá)降低可能是KOA形成的潛在危險(xiǎn)因素。

有研究顯示，VEGF參與多種關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展[21-22]。關(guān)于SCGF-β表達(dá)水平與KOA的關(guān)系的研究雖然不多見，但在不穩(wěn)定無癥狀頸動(dòng)脈斑塊相關(guān)研究中，可在患者斑塊內(nèi)檢測(cè)到SCGF-β，這提示SCGF-β參與局部和全身炎癥[23]。血清TNF-α和CRP水平與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，是衡量機(jī)體發(fā)生炎癥的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，非干預(yù)組兔子血清SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP的表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組(均P<0.05)，即KOA會(huì)導(dǎo)致兔子血清SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP的表達(dá)水平升高，提示KOA形成的過程中會(huì)伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本研究中，利用抗SCGF-β抗體和抗VEGF抗體治療KOA模型兔子后，發(fā)現(xiàn)SCGF-β組和SCGF-β+VEGF組血清SCGF-β的表達(dá)水平低于VEGF組與非干預(yù)組，VEGF組和SCGF-β+VEGF組血清VEGF的表達(dá)水平低于SCGF-β組與非干預(yù)組，而且SCGF-β組、VEGF組和SCGF-β+VEGF組血清TNF-α和CRP的表達(dá)水平均低于非干預(yù)組，SCGF-β+VEGF組血清TNF-α和CRP的表達(dá)水平均低于SCGF-β組與VEGF組(均P<0.05)，提示采用這兩種抗體中和KOA模型兔子血清中的SCGF-β或VEGF后，可抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，且兩者聯(lián)合干預(yù)的抗炎效果更佳[24]。為驗(yàn)證miRNA-29a對(duì)SCGF-β和VEGF的作用，本研究制備KOA軟骨細(xì)胞后分別轉(zhuǎn)染miRNA-29a 模擬物與抑制物，觀察兩者對(duì)KOA軟骨細(xì)胞SCGF-β和VEGF表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，上調(diào)miRNA-29a的表達(dá)(即Mimic組)，KOA軟骨細(xì)胞的SCGF-β、VEGF的蛋白及mRNA表達(dá)水平降低；反之，下調(diào)miRNA-29a的表達(dá)(即Inhibitor組)，轉(zhuǎn)染KOA軟骨細(xì)胞的SCGF-β、VEGF的蛋白及mRNA表達(dá)水平升高。表明miRNA-29a對(duì)KOA軟骨細(xì)胞的SCGF-β和VEGF的表達(dá)具有反向調(diào)控作用，這有助于減輕KOA引起的炎癥反應(yīng)，從而控制病情，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，KOA兔子血清miRNA-29a的表達(dá)水平降低，血清SCGF-β、VEGF、TNF-α和CRP的表達(dá)水平升高，下調(diào)SCGF-β和VEGF表達(dá)可抑制KOA兔子體內(nèi)的炎癥反應(yīng)；上調(diào)miRNA-29a表達(dá)水平可抑制KOA軟骨細(xì)胞SCGF-β、VEGF的表達(dá)，這有助于減輕KOA引起的炎癥反應(yīng)，從而控制病情。