李培群，鐘偉娟，梁 瑩，樊曉暉，張?jiān)龇?/p>

（廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，南寧 530021）

維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（retinoic acid induced gene I，RIG-I）是一種通過(guò)識(shí)別病毒核糖核酸來(lái)發(fā)揮效應(yīng)的傳感元件，屬于RIG-I樣受體家族，是主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的模式識(shí)別受體之一。與病毒RNA發(fā)生特異性識(shí)別后，RIG-I可活化抗病毒免疫應(yīng)答的信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子和Ⅰ型干擾素[1-2]。RIG-I不僅在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、吞噬等過(guò)程中有著廣泛的作用[3]，也在腫瘤發(fā)展進(jìn)程的各階段中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4]。巨噬細(xì)胞是天然免疫細(xì)胞的主要成員，依據(jù)細(xì)胞功能特征和分子表型，可以將活化的巨噬細(xì)胞分為多種亞群[5]，各亞群在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）屬于副黏病毒科，其病毒核心為不分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA。近年來(lái)，NDV因具有良好的抗瘤效果和對(duì)人體幾乎無(wú)毒的優(yōu)勢(shì)，成為參與生物治療的溶瘤病毒家族成員。到目前為止，NDV的抗腫瘤機(jī)制尚未完全清楚，可能與抗腫瘤免疫應(yīng)答的活化有關(guān)[7-8]。已有研究發(fā)現(xiàn)，NDV可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞白介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺瘤效應(yīng)[9-10]。鑒于RIG-I是特異性識(shí)別病毒RNA的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)元件，其在NDV誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞抗瘤效應(yīng)的活化過(guò)程中是否扮演關(guān)鍵角色，目前尚未有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法干擾小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7的RIG-I基因表達(dá)，進(jìn)一步研究RIG-I對(duì)NDV活化的小鼠巨噬細(xì)胞抗瘤因子TRAIL、IL-6表達(dá)的影響，為后續(xù)RIG-I與NDV的抗腫瘤免疫機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7由大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室惠贈(zèng)。NDV病毒W(wǎng)DK/JX/7793/2004株（簡(jiǎn)稱(chēng)為NDV7793）為本實(shí)驗(yàn)室保存已有。RIG-I基因特異性siRNA引物siRNA-RIGI1、siRNA-RIGI2及siRNA-NC由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)并合成。PCR引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。Lipotectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Opti-MEM培養(yǎng)基、無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ、總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染用Lipotectamine 3000介導(dǎo)siRNA-RIGI1、siRNA-RIGI2或siRNA-NC轉(zhuǎn)染入小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，設(shè)為siRNA-RIGI1組、siR-NA-RIGI2組和siRNA-NC組。siRNA-RIGI1上游序列：5’-GCAAGCAUUCAGAGACUAUTT-3’，下游：5’-AUAGUCUCUGAAUGCUUGCTT-3’；siRNA-RIGI2上游序列：5’-CCAGCAAUGAGAAUCCUAATT-3’，下 游：5’-UUAGGAUUCUCAUUGCUGGTT-3’；siRNA-NC上游序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在轉(zhuǎn)染前1 d，用含0.25% EDTA的胰酶消化、計(jì)數(shù)，按1×106個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種至6孔板，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用等體積的Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋siRNA和Lipotectamine 3000，靜置5 min，將稀釋后的Lipotectamine 3000加至稀釋的siRNA中，充分混勻，室溫放置10～15 min，即可獲得包含siRNA和Lipotectamine 3000的轉(zhuǎn)染復(fù)合物（1∶1）。待細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%時(shí)，除去原有培養(yǎng)基，更換不含F(xiàn)BS和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，各孔加入等量siRNA和Lipotectamine 3000轉(zhuǎn)染復(fù)合物，輕輕振蕩混勻，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換為不含雙抗、含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3分組方法 將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分為NDV組（加入血凝效價(jià)為1∶25的NDV7793）、PBS組（僅加入PBS）及空白組（不予處理），培養(yǎng)12 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)36 h，siRNA-RIGI1組、siRNARIGI2組分別加入NDV共培養(yǎng)12 h，即NDV+siRNA-RIGI1組、NDV+siRNA-RIGI2組。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)TRAIL、IL-6mRNA表達(dá)Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以其為模板利用TB染料法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：RIG-I上游：5’-ATTGTCGGCGTCCACAAAG-3’，下游：5’-GTGCATCGTTGTATTTCCGCA-3’；TRAIL上游5’-ATGATGGTGATTTGCATAGTGC-3’，下游：5’-TTCATCTCGTTGGTGAAGTACA-3’；IL-6上游：5’-CTCCCAACAGACCTGTCTATAC-3’，下游：5’-CCATTGCACAACTCTTTTCTCA-3’；GAPDH引物：5’-CCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3，下游：5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3’。采用2-ΔΔCT法計(jì)算TRAIL、IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 ELISA法檢測(cè)TRAIL、IL-6含量 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NDV活化后細(xì)胞RIG-I、TRAIL及IL-6mRNA表達(dá)及細(xì)胞上清液中TRAIL和IL-6含量 與空白組或PBS組比較，NDV組RIG-I、TRAIL及IL-6mRNA表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TRAIL和IL-6含量升高，見(jiàn)表1、圖1。

圖1 NDV 活化后RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TRAIL和IL-6含量

表1 NDV活化后RAW264.7 細(xì)胞RIG-I、TRAIL和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量 ，n=3

表1 NDV活化后RAW264.7 細(xì)胞RIG-I、TRAIL和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量 ，n=3

與空白組比較，*P＜0.01；與PBS組比較，ΔP＜0.01。

2.2轉(zhuǎn)染siRNA后RAW264.7細(xì)胞中RIG-ImRNA相對(duì)表達(dá)量 與空白組或siRNA-NC組比較，siRNA-RIGI1組和siRNA-RIGI2組RIG-ImRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，見(jiàn)圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA后RAW264.7 細(xì)胞中RIG-I mRNA 相對(duì)表達(dá)量

2.3干擾RIG-I表達(dá)后RAW264.7細(xì)胞中TRAIL和IL-6mRNA表達(dá)及細(xì)胞上清液中TRAIL和IL-6含量與NDV組比較，NDV+siRNA-RIGI1組、NDV+siRNA-RIGI2組TRAIL和IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TRAIL和IL-6含量降低，見(jiàn)圖3。

圖3 干擾RIG-I 表達(dá)后RAW264.7細(xì)胞中TRAIL和IL-6 mRNA表達(dá)及細(xì)胞上清液中TRAIL和IL-6的含量

3 討論

RIG-I也稱(chēng)DDX58，最早由Liu等[11]通過(guò)對(duì)全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）誘導(dǎo)的急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）細(xì)胞分化過(guò)程中差異表達(dá)基因的大規(guī)模篩選中鑒定得出。RIG-I在非特異性免疫反應(yīng)系統(tǒng)中對(duì)于識(shí)別病毒及清除病原體發(fā)揮著重要的作用。研究表明，RIG-I可以與病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的5’-三磷酸RNA及多種內(nèi)源性RNA相結(jié)合[12]，活化位于線(xiàn)粒體膜表面的IFN-β 啟動(dòng)子刺激器（IFN-βpromoter stimulator，IPS-1），介導(dǎo)Ⅰ型IFN的表達(dá)[13-14]，以達(dá)到識(shí)別和清除機(jī)體外源的病毒RNA的目的。除此之外，RIG-I在多種腫瘤（如黑色素瘤、結(jié)直腸癌等）發(fā)生發(fā)展的不同階段，通過(guò)增強(qiáng)凋亡誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)以及下游信號(hào)通路的活化，進(jìn)行抑癌或促癌調(diào)控[15]。由上可知，RIG-I作為一種存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的模式識(shí)別受體，在抗病毒免疫應(yīng)答及腫瘤調(diào)控方面都發(fā)揮重要的作用。

另外，RIG-I在溶瘤病毒抗腫瘤機(jī)制中的作用在也有報(bào)道。在腫瘤細(xì)胞中，RIG-I信號(hào)通路的激活增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)溶瘤病毒感染的耐受[16-18]。在免疫細(xì)胞中，作為危險(xiǎn)信號(hào)的溶瘤病毒可以激活免疫細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答，RIG-I分子起到信號(hào)傳遞的作用[19-20]。本研究中，溶瘤病毒NDV體外活化小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，使抗瘤相關(guān)分子TRAIL、IL-6的基因表達(dá)上調(diào)；ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NDV活化RAW264.7細(xì)胞后，TRAIL、IL-6的細(xì)胞外表達(dá)水平升高。由于RIG-I是巨噬細(xì)胞識(shí)別病毒RNA后誘導(dǎo)下游抗病毒/抗腫瘤轉(zhuǎn)錄因子激活的信號(hào)元件，這意味著RIG-I不僅能與病毒RNA相結(jié)合，在天然免疫中發(fā)揮作用，而且還可能參與NDV激活巨噬細(xì)胞上調(diào)抗腫瘤因子表達(dá)的途徑。為此，本實(shí)驗(yàn)利用siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的RIG-I基因進(jìn)行干擾，隨后用NDV活化RIG-I干擾的細(xì)胞，結(jié)果顯示，干擾RIG-I表達(dá)后，NDV活化的RAW264.7細(xì)胞中TRAIL、IL-6mRNA相對(duì)表達(dá)量及細(xì)胞外表達(dá)水平均下降，因此可以推測(cè)巨噬細(xì)胞的RIG-I基因被干擾后，不能正常識(shí)別NDV，從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中抗瘤的相關(guān)分子TRAIL、IL-6mRNA表達(dá)下調(diào)，推測(cè)RIG-I可能參與NDV活化巨噬細(xì)胞上調(diào)TRAIL、IL-6表達(dá)的過(guò)程。

綜上，沉默RIG-I基因可以抑制NDV活化小鼠巨噬細(xì)胞中TRAIL、IL-6基因的表達(dá)。由于考慮到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法獲得的RIG-I基因干擾細(xì)胞株無(wú)法傳代和保存，本課題組目前還利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建RIG-I沉默的巨噬細(xì)胞株，該工作正在進(jìn)行中。這些工作都將為后續(xù)RIG-I與NDV抗腫瘤免疫機(jī)制以及相關(guān)通路研究的實(shí)驗(yàn)工作奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也可能為NDV抗腫瘤相關(guān)研究和臨床免疫治療提供新的思路。