楊芬，譚一虎，肖鳴△

（1.長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院老年病科，武漢 430010；2.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)外科，武漢 430024）

帕金森疾?。≒arkinson’s disease，PD）是一種在中老年階段常見的慢性神經(jīng)性系統(tǒng)疾病，臨床癥狀主要包括運(yùn)動(dòng)癥狀和非運(yùn)動(dòng)癥狀，運(yùn)動(dòng)癥狀包含肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)緩慢等，非運(yùn)動(dòng)癥狀包括便秘、睡眠障礙、抑郁等，嚴(yán)重影響患者的心理和日常生活[1-2]。PD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與氧化應(yīng)激、遺傳、線粒體斷裂、炎癥反應(yīng)等過程均有關(guān)系，但尚無統(tǒng)一定論[3]。美多芭、左旋多巴、安坦等作為PD疾病常用藥物，雖然療效確切，但副反應(yīng)明顯，無法從根本上治療PD[4]，因此尋找高效的治療PD藥物是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究焦點(diǎn)。女貞子提取物（extract of Ligustrum lucidum，LLE）具有抗炎、抗腫瘤、降血糖血脂、護(hù)肝等藥理價(jià)值，在許多疾病治療中發(fā)揮較好的藥理作用[5]，但是LLE對(duì)PD疾病的治療鮮有報(bào)道。腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine-activated protein kinase，AMPK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulatory protein kinase，ERK）信號(hào)通路在細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)中起到重要作用，已然成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)之一。6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）是一種常用的導(dǎo)致多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元變性的神經(jīng)毒劑，包括內(nèi)源性和外源性兩種，一旦DA能神經(jīng)元攝入外源性6-OHDA，導(dǎo)致大量自由基釋放，最終造成神經(jīng)元受損而死亡。本實(shí)驗(yàn)通過6-OHDA構(gòu)建PD大鼠模型，給予大鼠LLE干預(yù)，旨在研究LLE對(duì)PD大鼠神經(jīng)炎癥以及AMPK/ERK信號(hào)通路的影響，以期為治療PD提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠100只（清潔級(jí)、7～8周齡、雄性、體重200～230 g），由北京賽特明強(qiáng)醫(yī)藥科技有限公司提供，許可證號(hào)：SYXK（京）2021-0044。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～25℃，濕度55%～75%，自由進(jìn)食、進(jìn)水。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且遵循國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2試劑與儀器LLE購(gòu)自陜西中鑫生物技術(shù)有限公司；LLE提取方法：將100 g女貞子粉末加入規(guī)格為1 000 mL圓底燒瓶中，經(jīng)純水浸泡30 min后，加入回流裝置中提取，過濾收集煎液；將濾渣再次回流提取，收集；藥煎液經(jīng)真空減壓等操作，濃縮至1 g/mL，得到LLE濃縮液；將濃縮液離心，將上清液經(jīng)過冷凍、干燥得到固體粉末，即為L(zhǎng)LE；抗壞血酸購(gòu)自于默克公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（貨 號(hào)：ml063357、ml076328、ml002859、ml077384）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）（貨號(hào)：kt27865）由武漢默沙克生物科技有限公司提供；AMPK、ERK、p-AMPK、酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）鼠 抗（貨 號(hào)：ab32047、ab32537、ab133448、ab137869）購(gòu)自Abcam公司；p-ERK（sc-7383）購(gòu)自上海易匯生物科技有限公司；6-OHDA購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；D-SW50光學(xué)顯微鏡購(gòu)自于深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自上海美谷分子儀器有限公司；HT-600C通用電泳儀由北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 PD大鼠模型的制備、分組、給藥 參照呂慧君等[6]方法建立PD大鼠模型：隨機(jī)選取85只大鼠，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，固定于立體儀上，切開顱頂皮膚，定位紋狀體，于前囟前1.0 mm、中線右3.0 mm作為注藥點(diǎn)1，前囟后0.2 mm、中線右2.7 mm、硬膜下5.0 mm作為注藥點(diǎn)2，用微量注射器于上述兩個(gè)注藥點(diǎn)分別注入4μL含0.2%抗壞血酸的6-OHDA，術(shù)后縫合傷口，同時(shí)預(yù)防傷口感染。術(shù)后喂養(yǎng)1周，給予注射0.5 mg/kg阿撲嗎啡，觀察大鼠旋轉(zhuǎn)行為。當(dāng)大鼠在30 min內(nèi)，向左旋轉(zhuǎn)圈數(shù)多于210圈時(shí)，說明PD大鼠建模成功[7]。建模過程中，大鼠死亡10只。將剩余75只大鼠隨機(jī)分為模型組、LLE劑量組（低、中、高）、陽(yáng)性對(duì)照組，每組15只；另取15只正常大鼠作為對(duì)照組；LLE低、中、高劑量組分別給予0.2 g/kg、0.4 g/kg、0.8 g/kg LLE灌胃[8]，陽(yáng)性對(duì)照組給予1.67 mg/kg美多芭灌胃[9]，對(duì)照組、模型組大鼠灌胃等體積的生理鹽水，各組大鼠每天灌胃1次，連續(xù)15 d。

1.2.2行為學(xué)檢測(cè)及樣本收集 分別于干預(yù)前、后統(tǒng)計(jì)各組大鼠30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，用戊巴比妥鈉麻醉并斷頭處死大鼠，低溫快速分離出含黑質(zhì)部位的腦組織，一部分置于4%多聚甲醛固定，用于免疫組化法檢測(cè)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；另一部分置于-80℃冰箱保存，用于ELISA、western blotting檢測(cè)。

1.2.3 ELISA檢測(cè)腦組織中氧化應(yīng)激、炎癥因子水平 取適量腦組織，加入PBS制備勻漿，4℃離心15 min（4 000 r/min），取上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說明書檢測(cè)腦組織中TNF-α、MDA、GSH、SOD、NO含量。

1.2.4免疫組化法檢測(cè)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)取4%多聚甲醛固定后的腦組織，在不同梯度的乙醇溶液中分別脫水5 min，制備石蠟切片，切片常規(guī)脫蠟，加入按照1∶500稀釋后的TH一抗，4℃孵育過夜，經(jīng)TBST洗滌，加入按照1∶5 000生物素化二抗室溫孵育1 h，PBS清洗，顯色劑顯色，中性樹脂封片。每組選5張切片，每張切片選取4個(gè)不同視野，分別統(tǒng)計(jì)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Western blotting法檢測(cè)大鼠腦組織中AMPK、ERK蛋白表達(dá) 取適量腦組織，加入裂解液，研磨并離心10 min（4℃、12 000 r/min）提取總蛋白，BAC蛋白定量試劑盒定量分析、SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入以1∶1 000稀釋的AMPK、ERK一抗，4℃恒溫箱孵育過夜，PBST緩沖液洗滌；加入1∶1 500稀釋的二抗室溫孵育1 h，ECL顯色、凝膠成像儀拍照，分析灰度值，以β-actin為內(nèi)參，定量AMPK、ERK蛋白表示水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD大鼠行為學(xué)檢測(cè)

與對(duì)照組相比，模型大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增加（P＜0.05）；與模型組相比，隨著LLE劑量增加，大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少（P＜0.05），其中LLE高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 LLE對(duì)PD大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的影響圈，，n=15

表1 LLE對(duì)PD大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的影響圈，，n=15

與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與LLE 低劑量組相比，cP＜0.05；與LLE 中劑量組相比，dP＜0.05，與本組干預(yù)前相比，eP＜0.05。

2.2 LLE對(duì)大鼠腦組織中氧化應(yīng)激水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠MDA含量明顯升高（P＜0.05），GSH、SOD含量均降低（P＜0.05）；與模型組相比，隨著LLE劑量增加，MDA含量降低，GSH、SOD含量升高（P＜0.05）；LLE高劑量組變化最為明顯，但各項(xiàng)指標(biāo)與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 LLE對(duì)PD大鼠腦組織中氧化應(yīng)激水平的影響 ，n=15

表2 LLE對(duì)PD大鼠腦組織中氧化應(yīng)激水平的影響 ，n=15

與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與LLE 低劑量組相比，cP＜0.05；與LLE 中劑量組相比，dP＜0.05。

2.3 LLE對(duì)大鼠腦組織中TNF-α、NO水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠TNF-α、NO含量增加（P＜0.05）；與模型組相比，LLE低、中、高劑量組TNF-α、NO含量隨著劑量增加，逐漸降低（P＜0.05）；LLE高劑量組變化最為明顯，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 LLE對(duì)PD大鼠腦組織中炎癥因子水平的影響 ，n=15

表3 LLE對(duì)PD大鼠腦組織中炎癥因子水平的影響 ，n=15

與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與LLE 低劑量組相比，cP＜0.05；與LLE 中劑量組相比，dP＜0.05。

2.4 LLE對(duì)大鼠腦組織中TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響

對(duì)照組大鼠TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多，細(xì)胞有序排列，細(xì)胞質(zhì)顏色較深，突起明顯；與對(duì)照組相比，模型組大鼠細(xì)胞排布紊亂，細(xì)胞質(zhì)顏色較深，突起短小，TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）；與模型組相比，隨著LLE劑量增加，細(xì)胞排布逐漸整齊有序，細(xì)胞質(zhì)顏色加深，突起逐漸變粗、變長(zhǎng)，TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增加（P＜0.05），LLE高劑量組各指標(biāo)與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1、表4。

表4 LLE對(duì)PD大鼠TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響 ，n=15

表4 LLE對(duì)PD大鼠TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響 ，n=15

與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與LLE 低劑量組相比，cP＜0.05；與LLE 中劑量組相比，dP＜0.05。

圖1 ENZZ對(duì)PD大鼠TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響（×100）

2.5 LLE對(duì)大鼠腦組織中AMPK、ERK蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，模型組大鼠腦組織中p-AMPK/AMPK、p-ERK/ERK比值均降低（P＜0.05）；與模型組相比，LLE低、中、高劑量組p-AMPK/AMPK、p-ERK/ERK比值均增加（P＜0.05），LLE高劑量組p-AMPK/AMPK、p-ERK/ERK比值最高，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5、圖2。

圖2 各組大鼠腦組織p-AMPK、AMPK、p-ERK、ERK表達(dá)

表5 LLE 對(duì)大鼠腦組織中p-AMPK、AMPK、p-ERK、ERK表達(dá)的影響 ，n=15

表5 LLE 對(duì)大鼠腦組織中p-AMPK、AMPK、p-ERK、ERK表達(dá)的影響 ，n=15

與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與LLE 低劑量組相比，cP＜0.05；與LLE 中劑量組相比，dP＜0.05。

3 討論

PD屬于第二大神經(jīng)性退行性疾病，僅次于阿爾茲海默病，其發(fā)病率高達(dá)0.3%[10]。DA神經(jīng)元的大量缺失和退化是造成PD的主要原因，與遺傳、炎癥反應(yīng)、衰老、氧化應(yīng)激等過程密切相關(guān)[11]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)腹腔注射6-OHDA建立PD大鼠模型，在行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果中，觀察到干預(yù)前模型組、藥物組以及陽(yáng)性對(duì)照組中大鼠在30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均多于210圈，表明PD大鼠模型構(gòu)建成功。

藥物治療PD，雖然有一定的療效，但長(zhǎng)期治療引發(fā)的并發(fā)癥以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)都會(huì)引起患者的信心缺失[12]。而中醫(yī)藥治療PD歷史悠久，多層次、多靶點(diǎn)以及多途徑的優(yōu)勢(shì)使得中醫(yī)藥在PD治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[13]。女貞子屬于木犀科植物，分布廣泛，其提取物含有多種中藥成分如熊果酸、黃酮類化合物、女貞子苷，具有廣泛的藥理作用，在治療肝病[14]、糖尿病[15]、骨質(zhì)疏松[16]等疾病中療效顯著，但是在治療PD方面很少報(bào)道。TNF-α 作為一種重要的細(xì)胞因子，在PD發(fā)病過程中起破壞作用。另外，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)會(huì)生成NO小分子化合物，這種物質(zhì)具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，但含量一旦超標(biāo)，便會(huì)造成細(xì)胞損傷[17]。本實(shí)驗(yàn)選用不同劑量的LLE進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，LLE組隨著劑量增加，大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)及腦組織TNF-α、NO含量均減少，表明LLE可以抑制炎癥反應(yīng)，改善PD大鼠不良癥狀。

研究表明，氧化應(yīng)激是致使神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的潛在機(jī)制[18]。TH在形成DA過程中起關(guān)鍵作用，產(chǎn)生使TH失活的大量自由基，誘發(fā)PD。SOD、GSH作為抗氧化劑，可以清除超氧自由基，阻止羥自由基產(chǎn)生，避免氧化應(yīng)激引起細(xì)胞。MDA是一種脂質(zhì)過氧化物，間接反映細(xì)胞受損程度[19]。AMPK作為調(diào)節(jié)因子，刺激合成線粒體，增強(qiáng)氧化代謝，維持代謝平衡，參與各種應(yīng)激反應(yīng)。ERK作為蛋白激酶家族中的一員，一旦被激活，便向細(xì)胞核傳遞信息，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡等[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同劑量的LLE干預(yù)后，大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)及腦組織MDA含量均隨著LLE劑量增加而降低，TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，GSH、SOD水平及p-AMPK/AMPK、p-ERK/ERK比值則呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；LLE高劑量組各項(xiàng)指標(biāo)與陽(yáng)性對(duì)照組無明顯差異。表明LLE可以抑制PD大鼠氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)TH表達(dá)，可能與激活A(yù)MPK/ERK信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，LLE可能通過激活A(yù)MPK/ERK信號(hào)通路，可改善PD大鼠氧化應(yīng)激水平，減輕炎性反應(yīng)，為中醫(yī)藥治療PD疾病提供了新的藥物參考，但作用機(jī)制較為復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。