王月琴，馮璐瑤，田鑫

0 引言

神經(jīng)母細胞瘤是一種起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，其中90%的腫瘤發(fā)生于10歲以下的兒童[1-2]。目前在神經(jīng)母細胞瘤細胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種基因改變，包括MYCN基因的擴增、間變性淋巴瘤激酶ALK基因的突變和染色體變化[3-7]。ALK基因的胚系突變和體系突變是罕見的家族性神經(jīng)母細胞瘤和散發(fā)性高危神經(jīng)母細胞瘤的主要驅(qū)動因素，其突變類型主要包括G1128A、R1192P、R1275Q、F1174L和F1245C等。這些突變導(dǎo)致了ALK激酶活性的結(jié)構(gòu)性激活，致使ALK-RAS-MAPK/ALK-PI3K信號通路級聯(lián)放大，這一特征是神經(jīng)母細胞瘤復(fù)發(fā)的主要因素，致使患者的存活率顯著降低[8-9]。針對ALK激酶的突變激活，ALK一代和二代抑制劑的成功研發(fā)實現(xiàn)了對神經(jīng)母細胞瘤的精準(zhǔn)治療。與其他小分子酪氨酸激酶抑制劑一樣，臨床上在使用ALK抑制劑治療神經(jīng)母細胞瘤時出現(xiàn)治療效果差，產(chǎn)生耐藥性問題[10-12]。因此，克服這種耐藥機制是當(dāng)前提高由ALK基因突變驅(qū)動的神經(jīng)母細胞瘤患者的生存質(zhì)量和生存時間所亟需解決的關(guān)鍵問題。

熱休克蛋白90（HSP90）是一種分子伴侶蛋白，幫助蛋白質(zhì)進行正確的折疊和組裝，防止蛋白質(zhì)聚集和降解[13-14]。HSP90在多種癌癥中均有高表達，增加了多種惡性表型，與不良預(yù)后密切相關(guān)[15-16]。HSP90抑制劑已在多種腫瘤中顯示出抗腫瘤作用，并能克服多種激酶抑制劑耐藥[17-20]。但HSP90抑制劑AUY922克服人神經(jīng)母細胞瘤對ALK抑制劑耐藥的研究未見報道。本研究以攜有ALK F1174L突變的人神經(jīng)母細胞瘤細胞為模型，探討AUY-922逆轉(zhuǎn)人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y和KELLY細胞對二代ALK抑制劑TAE684耐藥的作用，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

TAE684（批號S1108，純度99.64%）、AUY-922（批號S1069，純度99.08%）均購自上海藍木化工有限公司。四甲基偶氮唑藍（MTT）（批號M2128，純度98%）和二甲基亞砜（DMSO）（批號D2650，純度99.7%）均購自德國默克Sigma公司。人神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y（美國ATCC細胞庫）及KELLY（德國DSMZ細胞庫）；胎牛血清（美國Gibco公司）、RPMI1640培養(yǎng)基（批號10-040-CVR，美國Corning公司）；碘化丙啶（批號ST511）、RNase A（批號ST576）、BCA蛋白定量測定試劑盒（批號P0010S）、RIPA裂解液（批號P0013B）均購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑混合片劑（批號04693132001，瑞士Roche公司）；抗兔ALK抗體（批號3633）、抗兔p-Cdc2抗體（批號4539）、抗鼠CDC2抗體（批號9116）、抗兔p-Akt抗體（批號4060）、抗兔Akt抗體（批號4685）、抗兔p-Erk1/2抗體（批號4370）、抗兔Erk1/2抗體（批號4695）、抗兔p-Stat3抗體（批號9145）、抗鼠Stat3抗體（批號9139）、抗兔GAPDH抗體（批號5174）均購自美國Cell Signal Technology公司；兔二抗（批號111-035-003）、鼠二抗（批號115-035-003）均購自美國Jackson公司；ECL plus試劑（Picece，美國Thermofisher Scientific公司）?？烧{(diào)波長式微孔板酶標(biāo)儀（Spectra-MAX190，美國Molecular Devices公司）；流式細胞儀（FACSCalibur，美國BD公司）；凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDoc imaging system，美國Bio-Rad公司）。

1.2 化合物溶液的配制

TAE684和AUY-922均以二甲基亞砜為溶劑，溶解至10 mmol/L，在-20℃下保存。臨用前，再稀釋至所需濃度。

1.3 細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y和KELLY細胞株在含100 μg/ml鏈霉素、100 u/ml青霉素、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基、37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測AUY-922對SH-SY5Y和KELLY細胞增殖的影響

將SH-SY5Y和KELLY細胞分別按照1.5×103和6×103個/孔接種于96孔板內(nèi)，過夜貼壁后分別給予化合物TAE684（0.001、0.01、0.1、1、5和10 μmol/L）和AUY-922（0.001、0.01、0.1、1、5和10 μmol/L）作用72 h，并設(shè)陰性對照（control組），每組3個復(fù)孔。每孔加入MTT 20 μl孵育4 h，于酶標(biāo)儀波長490 nm處測吸光度值。計算各濃度藥物的抑制率（inhibition rate,IR），IR=[（OD對照組-OD化合物組）/OD對照組]×100%。采用四參數(shù)法擬合濃度-反應(yīng)曲線，計算IC50值。實驗獨立重復(fù)3次。

1.5 流式細胞儀檢測AUY-922對SH-SY5Y和KELLY細胞周期的影響

將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y和KELLY細胞按1×105個/孔接種于12孔板中，貼壁生長過夜后，在SH-SY5Y細胞中分別加入0.125、0.25、0.5 μmol/L的AUY-922，在KELLY細胞中分別加入0.05、0.1、0.2 μmol/L的AUY-922。作用24 h后，胰酶消化并收集細胞，4℃固定過夜；用含有RNase A（10 μg/ml）和PI（20 μg/ml）的PBS重懸，37℃孵育15 min，200目篩網(wǎng)過濾，流式細胞儀檢測細胞中DNA含量，每組樣品分析1×105個細胞。實驗結(jié)果用軟件Flowjo7.6進行分析。

1.6 Western blot法檢測AUY-922對Cdc2和ALK蛋白的表達及信號通路的影響

將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y和KELLY細胞接種于6孔板，貼壁生長過夜后，在SH-SY5Y細胞中分別加入0.125、0.25、0.5 μmol/L的AUY-922，在KELLY細胞中分別加入0.05、0.1、0.2 μmol/L的AUY-922。作用24 h后，每孔細胞加入100 μl的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，離心，收集上清液。BCA法定量，計算樣品蛋白濃度，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白上清液進行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜，于3%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。然后分別孵育一抗溶液ALK（1:1 000）、p-Cdc2（1:1 000）、Cdc2（1:1 000）、p-Akt（1:1 000）、Akt（1:1 000）、p-Erk（1:1 000）、Erk（1:1 000）及GAPDH（1:5 000），于4℃過夜后，洗膜3次，再與相應(yīng)二抗溶液鼠二抗（1:3 000）和兔二抗（1:3 000）室溫孵育1 h。同上洗膜3次后，用ECL plus試劑發(fā)色液顯色，化學(xué)發(fā)光信號用凝膠成像系統(tǒng)Chemi-Doc Imaging System檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

GraphPad Prism軟件進行t檢驗分析，數(shù)據(jù)均以（）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AUY-922逆轉(zhuǎn)SH-SY5Y和KELLY細胞耐藥

細胞增殖實驗結(jié)果顯示，SH-SY5Y 和KELLY細胞對ALK抑制劑TAE684顯示出了不同程度的耐藥，其IC50分別約為1.50和0.50 μmol/L（P＜0.05）；而SH-SY5Y和KELLY細胞均對HSP90抑制劑AUY-922顯示出高度敏感度，IC50分別約為0.30和0.12 μmol/L（P＜0.05），見圖1。

2.2 AUY-922引起SH-SY5Y和KELLY細胞發(fā)生G2/M期阻滯

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，AUY-922劑量依賴性地引起SH-SY5Y和KELLY細胞發(fā)生G2/M期周期阻滯，見圖2。

2.3 AUY-922抑制SH-SY5Y和KELLY細胞中Cdc2蛋白的表達

Western blot結(jié)果顯示，AUY-922能劑量依賴性地降低G2/M期關(guān)鍵調(diào)控蛋白Cdc2的表達，伴隨Cdc2蛋白的磷酸化水平的降低，見圖3。

2.4 AUY-922抑制SH-SY5Y和KELLY細胞中ALK蛋白的表達

Western blot結(jié)果顯示，AUY-922能劑量依賴性地降低驅(qū)動基因ALK蛋白的表達，同時劑量依賴性地抑制了ALK激酶下游p-Akt、p-Erk及p-Stat3信號通路，見圖4。

3 討論

神經(jīng)母細胞瘤是最常見的顱外兒童惡性腫瘤。特定分子改變?nèi)鏜YCN和ALK的異常表達是神經(jīng)母細胞瘤的致癌因素。ALK癌基因的酪氨酸激酶區(qū)域的激活突變是遺傳性神經(jīng)母細胞瘤的最常見原因，為神經(jīng)母細胞瘤的治療提供了關(guān)鍵的分子靶點。但臨床試驗運用ALK抑制劑克唑替尼治療攜有ALK基因激活突變的神經(jīng)母細胞瘤時，患者響應(yīng)率低（＜1/10）[21]。由此可見，大多數(shù)患者對ALK抑制劑克唑替尼產(chǎn)生了耐藥，其耐藥機制可能是克唑替尼不能有效抑制突變的ALK激酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)二代ALK抑制劑TAE684亦不能有效抑制SHSY5Y和KELLY細胞的增殖，這與臨床報道一致。因此，抑制ALK激酶的活性或者降低ALK蛋白的表達是體內(nèi)外克服神經(jīng)母細胞瘤增殖的關(guān)鍵手段。

HSP90是一種幫助蛋白質(zhì)折疊達到穩(wěn)定的分子伴侶，在多種癌癥中均有上調(diào)表達，與不良預(yù)后以及對化療、放射治療及分子靶向治療的耐藥密切相關(guān)[22-25]。本研究發(fā)現(xiàn)AUY-922能降低SH-SY5Y和KELLY細胞中ALK蛋白的表達，說明ALK F1174L亦是HSP90的客戶蛋白。AUY-922一方面從上游降解ALK F1174L客戶蛋白，另一方面促使下游Akt客戶蛋白發(fā)生降解，達到雙重抑制下游信號通路的作用。Cdc2是調(diào)控細胞周期G2/M期的關(guān)鍵蛋白[26-28]，AUY-922劑量依賴性地導(dǎo)致Cdc2發(fā)生降解，進而誘發(fā)SH-SY5Y和KELLY細胞發(fā)生G2/M期周期阻滯，導(dǎo)致細胞增殖受阻，達到抑制耐藥細胞增殖的作用。因此，AUY-922逆轉(zhuǎn)ALK抑制劑耐藥的作用機制可能與其降解ALK F1174L蛋白，削弱控制耐藥細胞生存及增殖的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。此外，AUY-922還通過降解細胞周期關(guān)鍵蛋白Cdc2，進一步抑制耐藥細胞的增殖，達到雙重克服耐藥作用。

綜上所述，本研究進一步證明了ALK F1174L是人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y和KELLY細胞發(fā)生的驅(qū)動蛋白，同時二代ALK抑制劑TAE684不能抑制ALK F1174L蛋白活性，從而產(chǎn)生耐藥。AUY-922一方面通過降解神經(jīng)母細胞瘤依賴的ALK蛋白和調(diào)控腫瘤細胞存活的AKT蛋白，導(dǎo)致多種致癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如Akt、Erk及Stat3被阻斷，從而抑制腫瘤耐藥細胞的增殖；另一方面AUY-922通過降解細胞周期調(diào)節(jié)因子Cdc2蛋白，引起SH-SY5Y和KELLY細胞發(fā)生G2/M期阻滯，進一步達到抑制腫瘤耐藥細胞增殖的作用。以上結(jié)果表明，攜有ALK F1174L突變的人神經(jīng)母細胞瘤細胞對二代ALK抑制劑TAE684產(chǎn)生耐藥性，而HSP90抑制劑AUY-922通過降解多種客戶蛋白，直接或間接抑制多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有效地克服了人神經(jīng)母細胞瘤細胞對二代ALK抑制劑的耐藥性。本研究為臨床應(yīng)用HSP90抑制劑克服人神經(jīng)母細胞瘤對ALK抑制劑的耐藥提供了理論依據(jù)。