劉藝欣，徐添姿，寧彪，雷軍，魏永長

0 引言

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）惡性程度高，是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤。新輔助化療聯(lián)合手術(shù)是骨肉瘤一線治療方案，靶向治療是目前骨肉瘤診療探索的新方向[1-2]。信號素（semaphorin,Sema）家族成員含有共同的Sema結(jié)構(gòu)域以及與此相連的叢蛋白-信號蛋白-整合素區(qū)（plexin semaphorin integrin,PSI）。隨著研究不斷深入，信號素家族目前已有20多種亞型，在神經(jīng)再生、血管生成、骨代謝、免疫代謝及腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。信號素6D（Sema6D）是信號素Ⅵ家族的一員，有研究表明其在胃癌血管生成中發(fā)揮作用[5]，但Sema6D在骨肉瘤中的作用尚不明確，因此本研究采用RNA干擾技術(shù)觀察Sema6D對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制，為骨肉瘤的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

6例骨肉瘤及瘤旁組織均來源于武漢大學(xué)中南醫(yī)院2020年9月—2021年9月病理診斷明確的骨肉瘤患者，所有組織來源均獲得武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨細(xì)胞hfob1.19和人骨肉瘤細(xì)胞系143B、MG63、U2OS購自中科院上海細(xì)胞庫，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC及人骨肉瘤細(xì)胞系HOS購自ATCC。高糖DMEM培養(yǎng)液、DMEM/F12培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，MEM/EBSS培養(yǎng)液、Mycco’5A培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司。所有細(xì)胞均添加10%FBS（Gibco，美國）和1%青/鏈霉素雙抗（Biosharp，中國）培養(yǎng)。

1.2.2 主要儀器試劑 RT-PCR儀（Bio-Rad，美國），酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國），ECL發(fā)光成像（Tannon，中國）。RIPA裂解液（碧云天，中國），ECL反光液、TRIzol試劑（Vazyme，中國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾科瑞，中國），Western blot凝膠試劑盒（雅酶，中國），CCK-8試劑（美侖，中國），人Sema6D ELISA試劑盒（酶免，中國），Lipofectamine 3000 (Invitrogen，美國)，Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室（Corning，美國）。anti-Sema6D（Abcam，英國），anti-P-PI3K/ERK/p-ERK/p-mTOR（ZENBIO，中國），anti-GAPDH/AKT/p-AKT/mTOR（Proteintech，中國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 骨肉瘤細(xì)胞及組織中Sema6D mRNA表達(dá)情況檢測 骨肉瘤患者標(biāo)本離體后及時液氮保存。按不同條件培養(yǎng)人成骨細(xì)胞hfob1.19及骨肉瘤細(xì)胞系143B、MG63、HOS和U2OS后收集一定數(shù)量細(xì)胞沉淀。TRIzol法提取組織及細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測Sema6D mRNA表達(dá)。特異性引物序列如表1所示，由北京擎科生物公司合成。

1.3.2 骨肉瘤細(xì)胞系Sema6D蛋白表達(dá)情況檢測 收集細(xì)胞后PBS洗滌兩次，PIPA裂解提取總蛋白，BCA法測定濃度。取25 μg總蛋白進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，恒流濕轉(zhuǎn)法（275 mA，90 min）將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入1:1000稀釋的Sema6D、GAPDH抗體，4℃搖床孵育過夜。次日用TBST漂洗（每次5 min，共5次），漂洗完成后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST再次漂洗后進(jìn)行ECL發(fā)光顯影，Image J軟件分析結(jié)果。

1.3.3 si-RNA的合成及轉(zhuǎn)染 靶向siRNA序列及陰性對照由蘇州吉瑪基因公司設(shè)計合成，干擾序列見表1。選取143B、MG63兩種細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將生長狀態(tài)良好的143B、MG63細(xì)胞分別加入含10%FBS的MEM、高糖DMEM培養(yǎng)基，放于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，按時更換培養(yǎng)基、傳代。在轉(zhuǎn)染前一夜，將細(xì)胞以1×106/ml接種于6孔板，融合度達(dá)50%～60%后使用脂質(zhì)體LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染，24 h后收集細(xì)胞提取RNA，48 h后收集蛋白。細(xì)胞分為si-NC、si-1、si-2三組。

1.3.4 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后，消化收集三組細(xì)胞計數(shù)重懸，按每孔100 μl均勻鋪在96孔板中，800個細(xì)胞/孔。待貼壁后每孔加入CCK-8試劑10 μl，37℃孵育2 h至培養(yǎng)基顏色發(fā)生明顯改變，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處細(xì)胞吸光度值，之后每間隔24 h檢測一次，共測量5次。記錄數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞增殖曲線圖。

1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后，消化收集三組細(xì)胞以一定密度鋪至6孔板中，使孔中細(xì)胞24 h后長至完全融合為宜。選取200 μl無菌槍頭從上到下均勻劃線，PBS沖洗干凈掉落細(xì)胞，每孔加入2 ml含5%血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后使用倒置顯微鏡觀察，并測量記錄，劃痕愈合率=（劃痕面積0h–劃痕面積24h）/劃痕面積0h×100%。

1.3.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后，消化收集三組細(xì)胞用PBS洗滌一遍后無血清培養(yǎng)基重懸，每組細(xì)胞按每孔20 000個均勻鋪在預(yù)先鋪好Matrigel基質(zhì)膠（1:8稀釋）的Transwell小室的上室中，下室加入15%FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后取出小室，棄去上室液體并用棉簽擦拭，4%的多聚甲醛室溫固定30 min后用0.05%的結(jié)晶紫染色，1 h后倒置顯微鏡觀察并記錄被染色的細(xì)胞數(shù)量。

1.3.7 體外血管形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)三組細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，5000 r/min離心20 min留取上清液制成腫瘤條件培養(yǎng)基，按人Sema6D ELISA試劑盒定量測定TCM中Sema6D含量，剩余TCM放置-20℃保存?zhèn)溆谩⑸L狀態(tài)良好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs按照一定密度均勻鋪在6孔板中，待細(xì)胞融合度為50%～60%后棄去舊培養(yǎng)基，PBS清洗1次，使用不同TCM繼續(xù)培養(yǎng)48 h。消化收集HUVECs，按照20 000個/孔均勻鋪在預(yù)先鋪有Matrigel基質(zhì)膠（不稀釋）的96孔板中，5 h后使用倒置顯微鏡觀察并記錄成管情況。

1.3.8 下游相關(guān)通路蛋白表達(dá)情況檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，收集三組細(xì)胞并用PBS洗滌1～2次，使用PIPA裂解提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量。取25 μg蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，方法同上。分別檢測三組細(xì)胞中mTOR/ p-mTOR、AKT/p-AKT、ERK/p-ERK、p-PI3K蛋白表達(dá)情況，Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）呈現(xiàn)，多組間選用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織及細(xì)胞系中表達(dá)情況

PCR結(jié)果顯示在6名骨肉瘤患者中，5名患者腫瘤組織中Sema6D mRNA表達(dá)高于瘤旁組織（均P＜0.05），四種人骨肉瘤細(xì)胞中Sema6D表達(dá)均高于人成骨細(xì)胞hfob（均P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示HOS細(xì)胞中Sema6D蛋白表達(dá)水平與hfob細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.999），余三種骨肉瘤細(xì)胞Sema6D蛋白表達(dá)水平高（均P＜0.01），見圖1。選擇Sema6D表達(dá)水平較高的143B和MG63細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 siRNA對骨肉瘤細(xì)胞Sema6D mRNA和蛋白表達(dá)的影響

PCR結(jié)果顯示，在143B和MG63中，si-1和si-2組Sema6D的mRNA表達(dá)明顯低于si-NC組（均P＜0.001），見圖2A。Western blot結(jié)果顯示，在143B和MG63中，si-1和si-2組Sema6D的蛋白表達(dá)明顯低于si-NC組（均P＜0.001），見圖2B。以上結(jié)果表明兩條siRNA均能有效降低143B及MG63細(xì)胞中Sema6D的表達(dá)。

2.3 Sema6D敲低抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖

用CCK-8法分別檢測si-NC、si-1和si-2三組細(xì)胞在0、24、48、72、96 h的OD值，并繪制生長曲線。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染si-1和si-2的143B細(xì)胞增殖能力明顯低于si-NC組（96 h時均P＜0.001）。轉(zhuǎn)染si-1和si-2的MG63細(xì)胞組的增殖能力與si-NC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（96 h時均P＜0.001），見圖3。

2.4 Sema6D敲低抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劃線24 h 后，143B-si-NC組細(xì)胞劃痕愈合比例（47±4）%大于143B-si-1組（17±5）%和143B-si-2（19±2）%（P＜0.01和P＜0.05）。MG63-si-NC、MG63-si-1、MG63-si-2三組細(xì)胞劃痕愈合比例分別為（65±5）%、（34±5）%、（47±4）%，抑制Sema6D表達(dá)后MG63的遷移能力明顯降低（均P＜0.001），見圖4。Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示143-si-NC組細(xì)胞穿過小室被固定染色的細(xì)胞數(shù)目（382±52個）多于143B-si-1組（238±18個）和143B-si-2組（178±60個）（P＜0.05和P＜0.01）。同樣，三組MG63細(xì)胞穿過小室被固定的細(xì)胞數(shù)分別為310±8個、157±34個、159±38個，敲低組細(xì)胞數(shù)明顯減少（均P＜0.01），見圖5。上述結(jié)果表明，Sema6D敲低抑制143B、MG63骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

2.5 骨肉瘤細(xì)胞來源的Sema6D促進(jìn)HUVECs體外血管形成能力

ELISA結(jié)果顯示143B-si-NC、143B-si-1、143B-si-2三組細(xì)胞上清液中Sema6D的含量分別為24.21±0.75、8.16±2.67和0.84±0.41 pg/ml。與對照組相比，143B敲低組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Sema6D的含量明顯下降（P＜0.0001和P＜0.001）。MG63-si-1組（15.76±0.1 pg/ml）和MG63-si-2組（19.12±0.11 pg/ml）細(xì)胞上清液中Sema6D的含量明顯低于MG63-si-NC組（38.25±6.27 pg/ml）（均P＜0.01），見圖6A。將HUVECs鋪在包被有Matrigel基質(zhì)膠的96孔板中5 h后可以在鏡下觀察管樣結(jié)構(gòu)的形成，143B-si-NC組TCM處理后血管形成數(shù)目（52±7個）多于143B-si-1組（19±4個）和143B-si-2組（25±5個）（P＜0.001和P＜0.01）。三組MG63細(xì)胞TCM處理后成管數(shù)目分別為55±7個、33±4個和21±4個，與MG63-si-NC組相比，敲低組血管形成數(shù)目減少（P＜0.01和P＜0.001），見圖6B～C。上述結(jié)果表明骨肉瘤細(xì)胞來源的Sema6D可以促進(jìn)HUVECs的體外血管形成能力。

2.6 siRNA對骨肉瘤細(xì)胞下游信號通路的影響

與143B-si-NC組相比，143B-si-1和143B-si-2兩組細(xì)胞p-PI3K、p-mTOR、mTOR和p-ERK四種蛋白表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；p-AKT表達(dá)水平僅在143B-si-1組中下降（P＜0.01）；ERK表達(dá)水平僅在143B-si-2組中下降（P＜0.01）；而AKT表達(dá)水平在三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在MG63細(xì)胞中，敲低Sema6D后，p-AKT、p-mTOR、mTOR、p-ERK和ERK五種蛋白表達(dá)水平明顯下降（均P＜0.05）；p-PI3K表達(dá)水平僅在MG63-si-1組下調(diào)（P＜0.01）；而AKT表達(dá)水平在三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖7。

3 討論

骨肉瘤好發(fā)于兒童及青少年血運(yùn)豐富的干骺端[6]。骨肉瘤惡性程度高，局部呈侵襲性生長，肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，因此早期行腫瘤切除治療是改善患者生存的最佳方法[1,3,7]。新輔助化療的出現(xiàn)使骨肉瘤患者的5年總生存率明顯升高，但耐藥性的存在以及肺轉(zhuǎn)移率的增加使骨肉瘤的治療仍處于困境。近年來針對TP53、RB1、BRCA2、VEGF及MDM2等骨肉瘤癌基因異常相關(guān)的研究越來越多，但目前研究成果距離臨床應(yīng)用仍有一定距離[8-11]。

Sema家族成員分子結(jié)構(gòu)相似，多為跨膜蛋白，在腫瘤發(fā)生、神經(jīng)血管再生及免疫調(diào)節(jié)等多方面發(fā)揮作用[4,12]。Sema4D、Sema7A、Sema3C等被證明在骨肉瘤、胃癌、非小細(xì)胞肺癌中能夠調(diào)節(jié)微環(huán)境，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4,13-15]。目前發(fā)現(xiàn)Ⅵ家族共有Sema6A～Sema6D四種類型，其中研究較多的是Sema6D[1,16-17]。Neufeld等[4]提出Sema6D在惡性胸膜間皮瘤中誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，影響生存，且在三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要作用[18]。除此之外，曲思璇、趙向陽等[19-20]通過免疫組織化學(xué)檢測出Sema6D在胃癌組織中高表達(dá)并與其惡性程度相關(guān)。在血管生成方面，Lu等[5]指出Sema6D能夠與PlexinA1直接結(jié)合從而激活VEGFR2介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與血管形成。Gong等[21]提出Sema6D在CircUBAP2調(diào)節(jié)下參與骨肉瘤順鉑耐藥。在骨微環(huán)境中，Sema6D由破骨細(xì)胞分泌，可溶性Sema6D能夠結(jié)合PlexinA1促進(jìn)破骨細(xì)胞活動[22]。

骨肉瘤病因復(fù)雜，其發(fā)生涉及胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變，其中PI3K/AKT/mTOR和ERK通路在其中扮演重要角色[23-24]，多項(xiàng)研究表明二者可以通過調(diào)節(jié)多種效應(yīng)分子如凋亡相關(guān)蛋白如Bax/Bcl-2、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶-2（CDK-2）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等參與骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡、自噬及血管形成等生物學(xué)行為，通過阻斷PI3K/AKT/mTOR和ERK信號級聯(lián)反應(yīng)可降低骨肉瘤細(xì)胞的惡性程度[25-27]。

本研究通過RT-PCR和Western blot方法證明Sema6D在人骨肉瘤組織以及細(xì)胞系中高表達(dá)，因此推測其可能作為促癌基因在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。之后通過RNA干擾技術(shù)降低骨肉瘤細(xì)胞系143B和MG63中Sema6D的表達(dá)，通過體外增殖及侵襲遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默Sema6D能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。利用HUVECs與TCM共培養(yǎng)的方法證明骨肉瘤細(xì)胞系來源的Sema6D可以促進(jìn)HUVECs體外血管形成。通過Western blot檢測下游相關(guān)信號通路的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR及ERK可能是Sema6D發(fā)揮上述作用的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

綜上所述，Sema6D在骨肉瘤中扮演促癌基因的作用，通過PI3K/AKT/mTOR和ERK通路調(diào)控骨肉瘤惡性生物學(xué)行為，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。在不斷完善現(xiàn)有研究成果的基礎(chǔ)上積極探索新的靶向基因以制備特異性靶向藥物，從而更好地為骨肉瘤臨床療效服務(wù)，這是目前骨肉瘤研究的目標(biāo)和重點(diǎn)之一。