李 承， 羅小青， 孫瑞迪， 劉明洋， 江 軍

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院臨床神經(jīng)電生理室，武漢 430016

顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)是青少年和成人最常見的局灶性癲癇之一，約三分之一的患者具有耐藥性，手術(shù)切除病灶是一種潛在的治療方法[1]。海馬硬化是TLE患者最常見的組織病理學(xué)改變[2]。臨床發(fā)現(xiàn)TLE的一個主要問題是其認(rèn)知共患病，并且認(rèn)知障礙會隨著患病時間的推移逐漸加重，對患者生活質(zhì)量的影響甚至比癲癇發(fā)作更大[2]。TLE常見的認(rèn)知障礙癥狀，不僅限于記憶缺陷，還可能涉及語言、執(zhí)行功能、注意力和處理速度等[3]。研究發(fā)現(xiàn)TLE認(rèn)知障礙可能在發(fā)病時就已經(jīng)存在，甚至在癲癇發(fā)作之前，提示兩者可能存在共同發(fā)病機制[4]。由于TLE的認(rèn)知功能損傷機制尚不清楚，其治療選擇有限。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)氯化鋰-匹羅卡品(li-pilo)可致癲癇大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體2B(NR2B-containing N-methyl-D-aspartate receptor，NR2B)表達(dá)或活性降低及海馬長時程增強(long-term potentiation，LTP)減弱，并與認(rèn)知障礙形成有關(guān)[5-6]。近期的一些研究提示了癲癇認(rèn)知障礙與年齡的相關(guān)性[7-8]。本研究采用li-pilo復(fù)制癲癇大鼠模型，造模后根據(jù)大鼠年齡分為1個月(1 M)、2個月(2 M)及3個月(3 M)癲癇模型，探討li-pilo癲癇大鼠認(rèn)知障礙與年齡的相關(guān)性及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級新生SD大鼠36只，購自華中科技大學(xué)實驗動物中心。出生第21天斷奶后，每6只子鼠一籠，于自然光下飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。

1.2 主要試劑及儀器

匹羅卡品、氯化鋰、硫酸阿托品、氯化鎂、氯化鈣(Sigma公司)；氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、葡萄糖(國產(chǎn)分析純)；小鼠抗NR2B單克隆抗體、兔抗NR2B(pTyr1472)多克隆抗體(Sigma公司)。Morris水迷宮(RD 1101-MWM，上海移數(shù)信息科技有限公司)；RM6240多道生理記錄儀(成都儀器廠)；針形電極(成都儀器廠)；振動切片機(ZQP-86型，上海之信儀器有限公司)；微電極操縱儀(MX160L，成都儀器廠)；微電極放大器(SWF-2W，成都儀器廠)。

1.3 癲癇大鼠模型的建立及評估

新生SD大鼠隨機分為氯化鋰-匹羅卡品(li-pilo)模型組、生理鹽水對照組。出生后第21天，模型組大鼠首先經(jīng)腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)，20 h后注射硫酸阿托品(1 mg/kg)，30 min后再注射匹羅卡品(25 mg/kg)；生理鹽水組腹腔注射等量生理鹽水。抽搐行為評價采用修改后的Racine分級標(biāo)準(zhǔn)[9]，即0級：無反應(yīng)；Ⅰ級：耳面部抽搐；Ⅱ級：肌陣攣，但無直立位；Ⅲ級：肌陣攣，伴直立位；Ⅳ級：全身強直陣攣發(fā)作；Ⅴ級：全身強直陣攣發(fā)作，并失去體位控制。制備癲癇模型，出現(xiàn)反復(fù)強直-陣攣發(fā)作，即癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)，1 h后給予10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射解除抽搐。選擇點燃后出現(xiàn)Racine Ⅳ級以上表現(xiàn)并存活的大鼠進行實驗。

1.4 Morris水迷宮實驗評估癲癇模型大鼠認(rèn)知功能

模型建立后根據(jù)大鼠年齡分為1月齡癲癇模型組(1 M TLE組)、1月齡正常對照組(1 M Control組)、2月齡癲癇模型組(2 M TLE組)、2月齡正常對照組(2 M Control組)、3月齡癲癇模型組(3 M TLE組)、3月齡正常對照組(3 M Control組)，每組6只大鼠。進行Morris水迷宮實驗，比較大鼠平均潛伏期、運動總路程來評估其認(rèn)知功能。每次實驗歷時5 d，每日于固定時間段訓(xùn)練4次，以大鼠每日4次訓(xùn)練的平均值作為當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績。

1.5 離體海馬腦片的制備

每組取3只大鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后斷頭，迅速取出大腦，放置在低于4℃的冰人工腦脊液(ACSF)中。用502膠將組織塊固定在振動切片機的切片槽里，倒入適當(dāng)?shù)谋鵄CSF，用振動切片機把含有海馬的大腦部分切成腦片(橫切面)，厚度500 μm。

1.6 離體腦片海馬CA1區(qū)場電位(fEPSP)記錄

將腦片移至界面型記錄槽，用溫ACSF以1～2 mL/min的流速持續(xù)灌流腦片，ACSF溫度控制在(30±1)℃，持續(xù)充入含有95%O2和5%CO2的混合氣體。在解剖顯微鏡下將雙極不銹鋼刺激電極置于海馬CA1的Schaffer側(cè)支通路上，記錄微電極置于海馬的CA1區(qū)，其尖端置于腦片表面下約200 μm處。場電位經(jīng)微電極放大器放大后，輸出信號用數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)RM6240進行信號的記錄、分析和處理。LTP的引導(dǎo)應(yīng)用了2串頻率為100 Hz的高頻刺激，每串持續(xù)1 s，間隔為10 s。數(shù)據(jù)處理以高頻刺激前場電位的波幅或斜率的均值作為基礎(chǔ)值，以高頻刺激后的波幅或斜率的均值與該腦片基礎(chǔ)值的百分比表示LTP。

1.7 Western blot檢測海馬NR2B表達(dá)

每組取3只大鼠，Western blot方法檢測其海馬NR2B表達(dá)水平。提取海馬組織蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，采用8% SDS-PAGE分離樣品，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別滴加一抗β-actin(1∶1000)、鼠抗NR2B單克隆抗體(1∶500)，4℃孵育過夜；洗膜后二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，采用Bio-Rad ChemiDocXRS +成像系統(tǒng)拍照，用Image J軟件進行灰度值分析，比較各組蛋白表達(dá)差異。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。水迷宮實驗、海馬場電位LTP的結(jié)果比較采用單因素方差分析；Western blot結(jié)果采用非配對t檢驗進行分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶功能呈年齡依賴性減退

模型建立后分別對1月齡、2月齡及3月齡癲癇大鼠及對照大鼠通過Morris水迷宮實驗觀察比較平均潛伏期及運動總路程，評估其學(xué)習(xí)記憶功能與年齡相關(guān)性。結(jié)果(圖1)顯示：①1月齡癲癇大鼠第1～5天平均潛伏期及運動總路程與年齡匹配對照大鼠比較均未見明顯改變，提示1月齡癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶功能無明顯減退。②2月齡癲癇大鼠在第1～3天平均潛伏期及運動總路程與年齡匹配對照大鼠比較無明顯改變，第4～5天平均潛伏期及運動總路程顯著高于年齡匹配對照大鼠，提示2月齡癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶功能出現(xiàn)一定程度減退。③3月齡癲癇大鼠在第1～5天平均潛伏期及運動總路程均顯著高于年齡匹配對照大鼠，提示3月齡癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶功能出現(xiàn)明顯減退。

A：1月齡大鼠平均潛伏期；B：2月齡大鼠平均潛伏期；C：3月齡大鼠平均潛伏期；D：1月齡大鼠平均運動路程；E：2月齡大鼠平均運動路程；F：3月齡大鼠平均運動路程；Control：正常對照組；TLE：癲癇模型組；與年齡匹配對照組大鼠比較，*P<0.05；n=6圖1 不同年齡癲癇大鼠與年齡匹配對照大鼠認(rèn)知功能比較Fig.1 Comparison of cognitive function between epilepsy rats of different ages and the age-matched controls

2.2 癲癇大鼠海馬LTP呈年齡依賴性減弱

水迷宮行為學(xué)實驗結(jié)束后，記錄離體腦片場電位評估LTP與年齡相關(guān)性(圖2)。結(jié)果顯示：①1、2及3月齡正常對照組間相比，基礎(chǔ)場電位斜率與幅值無顯著差異，高頻刺激后，海馬場電位斜率與幅值也未見顯著差異，提示正常大鼠在1～3月齡范圍內(nèi)LTP無顯著差異。②1月齡癲癇模型、2月齡癲癇模型及3月齡癲癇模型大鼠相比較，各組海馬基礎(chǔ)場電位斜率與幅值無顯著差異，但高頻刺激后，2月齡癲癇模型大鼠海馬場電位斜率較1月齡癲癇模型組顯著減弱，3月齡癲癇模型組海馬場電位斜率又比2月齡癲癇模型組顯著減弱，提示癲癇大鼠海馬LTP維持期在1～3月齡范圍內(nèi)出現(xiàn)年齡依賴性縮短。

A：1月齡、2月齡、3月齡正常對照組大鼠海馬場電位的斜率；B：1月齡、2月齡、3月齡模型組大鼠海馬場電位的斜率；C：1月齡、2月齡、3月齡正常大鼠海馬場電位的幅值；D：1月齡、2月齡、3月齡模型大鼠海馬場電位的幅值；fEPSP:場電位；Control：正常對照組；TLE：癲癇模型組；HFS：高頻刺激；n=3圖2 不同病程癲癇大鼠及年齡匹配對照大鼠海馬腦片場電位Fig.2 Comparison of field potential in hippocampus between the epilepsy rats in different disease status and the age-matched controls

2.3 癲癇大鼠海馬NR2B表達(dá)水平呈年齡依賴性降低

Western blot方法檢測各組大鼠海馬NR2B表達(dá)水平。結(jié)果(圖3)顯示：①1、2及3月齡正常對照組間比較，其海馬NR2B表達(dá)水平未見顯著差異，提示正常大鼠在1～3月齡范圍內(nèi)NR2B表達(dá)水平無明顯變化。②1月齡癲癇模型、2月齡癲癇模型及3月齡癲癇模型組大鼠比較，2月齡癲癇模型大鼠海馬NR2B表達(dá)水平較1月齡癲癇模型組明顯降低，3月齡癲癇模型組較2月齡癲癇模型組顯著降低，提示1～3月齡癲癇大鼠海馬NR2B表達(dá)水平呈年齡依賴性降低。

A：1月齡、2月齡、3月齡正常對照組及模型組大鼠海馬Western blot結(jié)果；B：1月齡、2月齡、3月齡正常對照組及模型組大鼠海馬NR2B表達(dá)水平統(tǒng)計圖；Control：正常對照組；TLE：癲癇模型組；與1月齡模型組大鼠比較，*P<0.05；n=3圖3 不同病程癲癇大鼠及年齡匹配對照大鼠海馬NR2B表達(dá)水平Fig.3 Comparison of expression of hippocampal NR2B between epilepsy rats in different disease status and the age-matched controls

3 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠認(rèn)知障礙與海馬LTP減弱相關(guān)，同時還發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠海馬NR2B表達(dá)水平降低[9]。本研究發(fā)現(xiàn)在1～3月齡范圍，癲癇大鼠海馬NR2B表達(dá)進行性降低，海馬LTP進行性減弱，可能導(dǎo)致癲癇大鼠認(rèn)知功能進行性減退，提示癲癇大鼠認(rèn)知障礙與年齡相關(guān)，同時還進一步證實海馬LTP及NR2B參與癲癇認(rèn)知障礙的發(fā)生發(fā)展。

認(rèn)知障礙是影響TLE患者生存質(zhì)量的一個主要問題，普遍認(rèn)為癲癇的認(rèn)知共病通常與潛在的病因、癲癇發(fā)作的年齡、癲癇發(fā)作的頻率、發(fā)作間期異常放電以及抗癲癇藥物相關(guān)[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)癲癇認(rèn)知障礙與年齡也有明顯相關(guān)性。Hermann等[7]報道TLE患者與年齡和性別匹配的健康對照組相比，在4年內(nèi)出現(xiàn)進行性認(rèn)知障礙。另有研究提示W(wǎng)AG/Rij失神癲癇大鼠模型存在年齡依賴性學(xué)習(xí)和記憶缺陷[8]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)隨著癲癇病程延長，癲癇大鼠認(rèn)知功能也出現(xiàn)進行性減退。這些研究均強調(diào)了認(rèn)知障礙與年齡的相關(guān)性。

研究報道認(rèn)知障礙更容易出現(xiàn)在早發(fā)性、藥物依賴性癲癇以及頻繁發(fā)作的個體中，如癲癇性腦病，同時短暫的發(fā)作間期癇性放電也會導(dǎo)致短暫的認(rèn)知障礙[10]。有證據(jù)表明隨著時間的推移，不可控的癲癇發(fā)作可能會對認(rèn)知能力產(chǎn)生負(fù)面影響，同時發(fā)作間期放電還與學(xué)習(xí)和記憶的改變有關(guān)[11]。在我們的研究中，正常大鼠在1～3月齡范圍內(nèi)，認(rèn)知障礙未見明顯減退，但癲癇大鼠認(rèn)知功能明顯減退，并隨著月齡增加，出現(xiàn)進行性減退，提示癲癇發(fā)作及發(fā)作間期異常放電可能對癲癇大鼠認(rèn)知功能產(chǎn)生負(fù)面影響。

海馬組織是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，由于其特殊脆弱性(不耐缺氧、缺血及神經(jīng)毒性物質(zhì))，也參與癲癇、阿爾茨海默病等神經(jīng)精神疾病的病理生理過程[12]。海馬LTP的形成在細(xì)胞水平上與記憶過程有著相似分子機制。LTP分為誘導(dǎo)期和維持期，其中維持期與記憶的儲存密切相關(guān)[13]。NR2B是興奮性谷氨酸受體NMDAR一種亞基，參與LTP維持[14]。我們研究中發(fā)現(xiàn)海馬NR2B表達(dá)年齡依賴性降低，海馬LTP也呈現(xiàn)年齡依賴性減弱，提示癲癇認(rèn)知障礙的可能機制：NR2B表達(dá)降低，繼而海馬LTP維持受損，最終導(dǎo)致癲癇大鼠認(rèn)知功能減退。我們后續(xù)還會通過正反干預(yù)等手段繼續(xù)研究三者之間相關(guān)性。

多項證據(jù)表明，癲癇患者的認(rèn)知功能障礙可能與病理性腦老化和神經(jīng)退行性病變相關(guān)機制有關(guān)[15]。引人注目的是，難治性慢性癲癇患者表現(xiàn)出腦老化晚期的影像學(xué)特征和心室加速擴張，類似于阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性認(rèn)知障礙的特征[16]。與癲癇和認(rèn)知障礙相關(guān)的其他疾病中，如唐氏綜合征和脆性X綜合征，也發(fā)現(xiàn)APP和淀粉樣蛋白-b42等神經(jīng)退行性病變物質(zhì)增加[17-18]。這些聯(lián)系增加了癲癇超興奮網(wǎng)絡(luò)引發(fā)神經(jīng)退行性病變的可能性，同時也提示癲癇認(rèn)知障礙與大腦加速老化有關(guān)。本實驗中癲癇大鼠認(rèn)知障礙是否也與大腦老化加速有關(guān)，目前尚不清楚，有待進一步研究。