陳 艷， 王梓璇， 冀彩麗， 華夢晴， 宋傳旺

蚌埠醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院免疫學教研室，慢性疾病免疫學基礎與臨床安徽省重點實驗室，蚌埠 233030

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是急性全身炎癥過程的肺部表現(xiàn)，ALI的主要特征為彌漫性肺泡損傷、肺水腫形成、中性粒細胞源性炎癥。臨床上表現(xiàn)為肺順應性降低，嚴重低氧血癥，雙側肺浸潤。ALI是臨床上常見的危重癥，死亡率高達40%左右[1-2]。熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)是熱休克蛋白家族中最常見成員，分子量約70 kD。正常情況下HSP70在細胞內(nèi)表達水平較低，而在高溫及各種有害應激狀態(tài)下，HSP70的合成增加[3]。HSP70通常被認為是細胞內(nèi)分子伴侶，參與新生肽鏈的折疊與裝配、蛋白的跨膜運送、熱變性蛋白的修復等[4]。但有研究發(fā)現(xiàn)HSP70也存在于細胞外，特別是在特定的應激條件下，HSP70能刺激原代氣道上皮細胞的促炎反應，誘導炎癥細胞因子的釋放[5-6]。有學者在慢性阻塞性肺部疾病患者的肺組織中發(fā)現(xiàn)了與疾病嚴重程度相關的HSP70表達升高，并且當HSP70被分泌到細胞外時可引發(fā)炎癥反應[7-8]。另有研究表明HSP70可從病毒感染的氣道上皮細胞釋放，導致中性粒細胞的募集和激活[9]。考慮HSP70與中性粒細胞的募集、激活及炎癥反應有關，因此可能參與了ALI的發(fā)病，本研究構建ALI模型小鼠，并鼻滴HSP70抗體(anti-HSP70)阻斷HSP70的作用，檢測小鼠肺組織炎性細胞浸潤、肺干/濕重比和炎性因子產(chǎn)生情況，以觀察HSP70對ALI發(fā)病的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清為杭州四季青生物技術有限公司產(chǎn)品；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自美國Sigma公司；重組小鼠HSP70蛋白、anti-HSP70購自美國Abcam公司；HSP70、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)ELISA檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司；GAPDH抗體、HSP70抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；胰酶組織細胞消化液、聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠配置試劑盒、NP-40蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、HRP標記山羊抗小鼠IgG、聚偏二氟乙烯膜膜(PVDF膜)購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 肺泡上皮細胞株MLE-12的培養(yǎng)和實驗處理

小鼠肺泡上皮細胞株購于上海紀寧實業(yè)公司。MLE-12細胞在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)液中，5%CO2和37℃培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，0.25%胰酶消化，隔日進行1次傳代。實驗前取對數(shù)生長期細胞，以1×105/mL接種12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后備用。

1.2.1 anti-HSP70作用的MLE-12細胞模型 培養(yǎng)貼壁的細胞中加入LPS 500 ng/mL繼續(xù)刺激12 h，加入anti-HSP70(200 ng/mL)處理12 h，收集細胞上清，8000 r/min離心5 min，取上清液，使用ELISA法檢測促炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的含量。

1.2.2 HSP70作用的MLE-12細胞模型 培養(yǎng)貼壁的細胞中加入不同濃度(10～500 ng/mL)HSP70刺激24 h，加入與布孔細胞等量的FITC標記的凋亡細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4%臺盼藍淬滅細胞外熒光10 min,PBS清洗3次，收集細胞，流式細胞儀檢測吞噬率的變化。

1.3 原代小鼠肺泡上皮細胞的分離培養(yǎng)與處理

ICR小鼠(購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心)氣管插管后用PBS進行支氣管肺泡灌洗，盡可能去除支氣管肺泡中白細胞。然后通過肺動脈用PBS灌洗小鼠肺部，直至肺部變白。小心取出雙肺置于預冷的PBS液中，清洗2～3次，剪碎肺組織，加入胰酶(0.25%)、膠原酶(40 μg/mL)和DNA酶(100 μg/mL)37℃消化30 min，消化液1500 r/min離心10 min后棄上清，加入含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，將細胞懸液收集入培養(yǎng)皿中于5%CO2和37℃溫箱中培養(yǎng)2 h，將非粘附細胞收集后接種于預先鋪有膠原的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)觀察細胞生長的狀態(tài)和形態(tài)特征，約1周左右細胞狀態(tài)良好，采用磁珠分選法去除CD45陽性細胞。收集CD45陰性細胞即為肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cells，AECs)，使用含10%FBS的DMEM重懸后進行計數(shù)，接種于預先鋪有膠原的6孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后以HSP70刺激24 h，再加入與接種細胞等量的FITC標記的凋亡細胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細胞使用流式細胞儀檢測吞噬率的變化。

1.4 急性肺損傷動物模型的建立及實驗分組處理

雌性ICR小鼠(8～10周齡，25～30 g)隨機分為4組：正常對照組、ALI組、anti-HSP70+ALI組、同型IgG+ALI組。ALI模型小鼠采用LPS(5 mg/kg)經(jīng)鼻腔滴入1次激發(fā)形成；正常對照組使用等量磷酸鹽緩沖液PBS滴鼻；anti-HSP70+ALI組在小鼠用LPS滴鼻前2 h以及滴鼻后6 h，經(jīng)氣道滴入anti-HSP70(0.25 mg/kg)；同型IgG+ALI組則采用等劑量的同型IgG代替anti-HSP70對ALI模型小鼠進行預處理。各組小鼠在氣道滴入PBS或LPS 24 h后，取支氣管肺泡灌洗液和肺組織進行后續(xù)檢測。

1.5 肺組織病理學檢測

取各組小鼠肺組織，4%多聚甲醛固定24 h，全自動組織脫水機脫水透明12 h，石蠟包埋，切片機上將石蠟塊切成5 μm厚的薄片。切片后使用不同濃度的二甲苯進行脫蠟，高濃度到低濃度乙醇浸泡處理后行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察拍照。肺損傷評分采用Smith評分法對肺間質(zhì)水腫、中性粒細胞浸潤、肺泡與間質(zhì)出血、氣道上皮損傷、透明膜形成等方面分別進行評分。無損傷為0分；損傷面積<25%為1分；損傷面積25%～為2分，損傷面積50%～為3分；損傷面積75%～為4分。每組選取5個高倍(×400)顯微鏡視野，取其平均值，計算肺組織學評分。

1.6 肺泡灌洗液中細胞計數(shù)與染色

用PBS灌洗小鼠肺組織，收集5 mL灌洗液，1500 r/min離心5 min，棄去上清，將細胞沉淀加入100 μL含10%血清的PBS，混勻后取10 μL滴加于玻片上，輕輕涂布均勻至1 cm2左右，在超凈臺中自然風干，加入固定液覆蓋整個標本，在超凈工作臺中自然風干，隨后滴加改良瑞士染液，覆蓋整個標本，洗耳球輕柔吹打充分混勻，染色5 min，細流水沖洗，待玻片晾干后于顯微鏡下進行分類計數(shù)。

1.7 小鼠肺組織濕/干重比測定

各組小鼠解剖后，小心取出其肺組織放置在PBS中，清洗2遍以去除其表面的血液。將肺組織放置在吸水紙上，除去其表面的水分，然后統(tǒng)一稱量右肺的質(zhì)量，記錄為濕重(W)；緊接著將右肺組織放置在干燥箱中48 h至肺組織質(zhì)量恒定后取出稱取質(zhì)量，記錄為干重(D)，計算各組小鼠肺組織的濕/干重比(W/D)。

1.8 流式細胞術檢測吞噬作用

完成實驗處理的MLE-12或原代AEC細胞用4%臺盼藍淬滅細胞外熒光10 min,PBS洗滌3次，再用0.25%胰酶消化，終止消化后離心，吸棄上清，4%多聚甲醛固定，使用DxP Athena流式細胞儀檢測吞噬凋亡細胞情況。

1.9 免疫印跡實驗

取小鼠肺組織，勻漿后采用NP-40裂解液提取蛋白，BCA法進行蛋白定量。取等量蛋白在8% SDS-PAGE凝膠中電泳(70 V，30 min轉(zhuǎn)110 V，1 h)，轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜上(200 mA，2 h)，以5%工業(yè)脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗(HSP70抗體，稀釋度1∶5000)4℃孵育過夜，TBST洗膜后以HRP標記的二抗(HRP-山羊抗小鼠IgG，稀釋度1∶5000)孵育2 h，增強化學發(fā)光法顯影。以目的條帶和GAPDH條帶灰度比值對蛋白表達水平進行半定量。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附實驗

收集小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的離心上清，及分組處理后的細胞培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒操作說明，檢測其中HSP70、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。根據(jù)酶標儀測得的A450 nm值，制作標準曲線，計算濃度。

1.11 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 急性肺損傷小鼠肺組織和BALF中HSP70產(chǎn)生增加

首先以免疫印跡法和酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測ALI小鼠肺組織及BALF中HSP70含量。與對照組比較，ALI小鼠肺組織中HSP70的表達增加(P<0.01，圖1A)，BALF中HSP70分泌增多(P<0.01，圖1B)。這些結果提示本研究采用的ALI模型小鼠肺組織HSP70產(chǎn)生增加。

A：免疫印跡法檢測小鼠肺組織中HSP70表達；B：酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測小鼠BALF中HSP70含量；與正常對照組(Control)比較，**P<0.01圖1 ALI模型肺組織和BALF中HSP70產(chǎn)生增加Fig.1 HSP70 was increased in lung tissues and BALF of ALI model

2.2 anti-HSP70減輕ALI模型小鼠的肺部炎癥

采用anti-HSP70滴鼻以阻斷HSP70的效應，檢測肺組織病理改變及炎癥情況。HE染色結果顯示，與正常對照組小鼠比較，ALI小鼠肺組織中多形核中性粒細胞(PMN)明顯增加，肺泡充血和滲出明顯，炎癥細胞浸潤增加；與ALI組相比，anti-HSP70+ALI組小鼠肺組織中炎性細胞浸潤減少，肺泡充血與滲出情況有所好轉(zhuǎn)(圖2A)。肺泡灌洗結果顯示，anti-HSP70滴鼻處理后，與ALI組比較，anti-HSP70+ALI組小鼠BALF中HSP70的含量降低(圖2B，P<0.05)，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的分泌減少，蛋白含量明顯減少(圖2C、2D，均P<0.05)，PMN數(shù)目減少(圖2E,P<0.05)。anti-HSP70滴鼻處理還使ALI小鼠肺濕/干重比值明顯降低(圖2F,P<0.05)。

1：Control；2：ALI；3：anti-HSP70+ALI；4：IgG+ALI；A：HE染色評價肺組織損傷(×200)；B：酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測小鼠BALF中HSP70含量；C：酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量；D：BALF中蛋白含量測定；E：BALF中多形核中性粒細胞計數(shù)；F：肺組織濕/干重比；與正常對照組(Control)比較，*P<0.05 **P<0.01；與ALI組比較，#P<0.05圖2 HSP70抗體對ALI模型小鼠肺部炎癥的影響Fig.2 Effect of HSP70 antibody on lung inflammation in ALI mouse model

2.3 anti-HSP70降低LPS誘導的MLE-12細胞炎性細胞因子的產(chǎn)生

酶聯(lián)免疫吸附實驗顯示，與LPS組比較，HSP70抗體預處理的anti-HSP70+LPS組培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β含量下降(均P<0.05，圖3)。

1：Control；2：LPS；3：anti-HSP70+LPS；4：IgG+LPS；與Control組比較，**P<0.01；與LPS組比較，#P<0.05圖3 HSP70抗體對LPS刺激的MLE-12細胞分泌炎性細胞因子的影響Fig.3 Effect of HSP70 antibody on inflammatory cytokine secretion of LPS stimulated MLE-12 cells

2.4 HSP70減弱肺泡上皮細胞吞噬凋亡細胞的作用

為探討HSP70促進ALI小鼠肺部炎癥的可能機制，我們觀察了HSP70對肺泡上皮細胞吞噬凋亡細胞的影響。采用不同濃度(10～500 ng/mL)的HSP70刺激肺泡上皮細胞株MLE-12細胞后，流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)100～500 ng/mL的HSP70可抑制MLE-12細胞對凋亡細胞的吞噬，其中以200 ng/mL濃度組的抑制作用最為明顯(P<0.01，圖4A、4B)。進一步觀察HSP70對原代AECs吞噬凋亡細胞作用的影響。首先提取分選的小鼠原代AECs經(jīng)流式細胞術檢測，符合肺泡上皮細胞表型CD45-EPCAM+的細胞純度大于95%(圖5)；將分選得到的小鼠原代AECs培養(yǎng)貼壁后加入200 ng/mL HSP70刺激24 h，流式細胞術檢測其對凋亡細胞的吞噬變化，結果顯示原代AECs的吞噬率降低(P<0.01，圖6)。

A：檢測MLE-12細胞吞噬作用的流式圖；B：流式統(tǒng)計圖，與Control組比較，*P<0.05**P<0.01圖4 HSP70對MLE-12細胞吞噬凋亡細胞的抑制Fig.4 Inhibitory effect of HSP70 on phagocytosis of apoptotic cell by MLE-12 cells

A：普通光學顯微鏡下所見(×40)；B：流式檢測分選，顯示CD45-/EPCAM+細胞>95%圖5 原代培養(yǎng)肺泡上皮細胞的鑒定Fig.5 Identification of primary alveolar epithelial cells

與Control組比較，**P<0.01圖6 HSP70(200 ng/mL)對原代肺泡上皮細胞吞噬功能的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of HSP70(200 ng/mL)on phagocytosis function of primary alveolar epithelial cells

3 討論

HSP70是熱休克蛋白家族成員之一，分子量約為70 kD，是普遍存在的分子伴侶[10]。機體在高溫及微生物感染等應激狀態(tài)下HSP70的產(chǎn)生會增加[11-12]，如高血壓、急性感染患者外周血液中HSP70含量增加[13-14]。最近有報道表明，在霉菌毒素刺激下，大鼠肺組織中HSP70的表達顯著增加[15]。本研究也證明HSP70在ALI小鼠中肺組織的表達和肺泡灌洗液中的分泌均增加，提示HSP70在ALI中可能有重要作用。本研究結果顯示，使用anti-HSP70滴鼻能減弱ALI導致的小鼠肺泡中性粒細胞數(shù)量增多及炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)生成的增加，并能降低肺蛋白含量，有助于減輕肺水腫，說明HSP70促進ALI肺部炎癥進展。肺泡上皮細胞在ALI進展中起關鍵作用，LPS可誘導小鼠肺上皮MLE-12細胞促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β)表達水平升高[16]。我們的結果顯示在LPS刺激的MLE-12細胞中加入anti-HSP70后TNF-α、IL-1β生成量減少。有研究表明，HSP70不僅能激活氣道上皮細胞促炎基因的表達，還可刺激其NLRP3炎癥小體、IL-1β和ATP的釋放，從而加重慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的病情并影響預后[9，17]。HSP70在中性粒細胞吞噬結核分枝桿菌過程中，觸發(fā)巨噬細胞釋放IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子，從而促進炎癥反應[18]。另外，HSP70可誘導心肌細胞血管內(nèi)皮細胞粘附分子(ICAM-1)和IL-6的表達增加，引起心肌細胞的炎癥和收縮力下降[19]。這些研究均提示HSP70有促炎作用，本研究結果與之一致。

吞噬作用是宿主細胞對病原微生物和凋亡細胞的特異性識別和吞噬，是機體抗感染和維持組織穩(wěn)態(tài)的重要過程[20]。AECs參與構成肺泡屏障，ALI發(fā)生時AECs受損，其損傷后釋放的炎性介質(zhì)啟動了復雜的炎性反應，由于AECs數(shù)量較多，因此AECs在ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[21-22]。AECs通過吞噬作用清除凋亡細胞，減輕ALI的炎癥反應，因此AECs對凋亡細胞的吞噬有助于ALI氣道炎癥的消退，從而有助于重塑肺泡屏障[23]。凋亡細胞的有效清除對維護機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)至關重要，如果正常細胞對凋亡細胞的清除能力受損或細胞死亡超過正常細胞的清除能力，凋亡細胞通過自身以及誘導正常細胞釋放促炎介質(zhì)(IL-1和TNF-α等)，進一步誘導炎癥反應[24]。本研究發(fā)現(xiàn)HSP70可抑制AECs對凋亡細胞吞噬，說明其延長了死亡細胞來源炎性內(nèi)容物的刺激時間，這也可能是HSP70促進ALI肺部炎癥的原因。細胞外HSP70可以與上皮細胞RAGE受體相互作用，并且隨著RAGE表達降低，HSP70啟動的ERK1/2激活和和NF-κB轉(zhuǎn)錄及前炎癥因子產(chǎn)生減少，說明RAGE是上皮細胞表面識別HSP70的受體[25]。另外，有研究表明，CD91也是巨噬細胞識別HSP70的受體[26]。由于RAGE和CD91都是吞噬凋亡細胞時用來識別磷脂酰絲氨酸的受體[27]，因此可能是HSP70與這些受體相互作用后，占據(jù)了這些受體，影響了對凋亡細胞的識別和吞噬，這也可能是我們的研究中HSP70抑制AECs吞噬凋亡細胞的原因。

綜上所述，HSP70促進了ALI小鼠肺部炎癥反應，這可能是由于HSP70抑制了肺泡上皮細胞對凋亡細胞的吞噬所致。