李鵬程， 秦亞運， 何曉婕， 唐朝暉， 劉 飛， 劉木根△

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協和醫(yī)院眼科，武漢 430022 2華中科技大學生命科學與技術學院，武漢 430074 3華中科技大學醫(yī)院，武漢430074

無脈絡膜癥(choroideremia，CHM；OMIM：#303100)是一種少見的X連鎖的遺傳性視網膜疾病，其患病率約為1∶50000～1∶100000，以感光細胞、視網膜色素上皮(RPE)和脈絡膜的進行性退化為主要特征[1-3]。CHM基因(OMIM：*300390)是無脈絡膜癥的唯一致病基因，編碼REP-1蛋白[4]。REP-1蛋白對于Rab蛋白的異戊二烯化修飾和正確定位是必需的，其功能障礙會導致細胞囊泡運輸異常和蛋白質錯誤定位[5-6]。CHM的主要癥狀為進行性加重的夜盲、漸進性視野縮小，晚期逐漸出現中心視力下降，與視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)的臨床癥狀高度重疊，極易被誤診為RP[7]。因此，遺傳分析對于CHM的精準診斷十分必要。本文對3個中國無脈絡膜癥家系進行了臨床和遺傳學研究，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 參與者與臨床檢查

本研究招募了2016～2021年在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協和醫(yī)院和華中科技大學醫(yī)院就診的3個中國漢族非近親家系。納入標準：①滿足無脈絡膜癥的臨床診斷標準，有夜盲病史，特征性眼底表現及家族史符合X連鎖遺傳特征；②通過分子遺傳學方法明確CHM基因突變。排除有其他眼部疾病及不能配合完成眼科檢查者[8]。所有參與者或其法定監(jiān)護人均已簽署知情同意書。本研究經過華中科技大學倫理委員會的審查與批準。所有參與者在協和醫(yī)院進行了全面眼科檢查，包括最佳矯正視力測量(best corrected visual acuity，BCVA)、裂隙燈觀察、眼底彩照和光學相干斷層掃描(spectral domain optical coherence tomography，SD-OCT)等。采集參與者的外周血標本2 mL，采用試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit)提取基因組DNA，并測定濃度和純度[9-10]。

1.2 全外顯子組測序及生物信息學分析

全外顯子組測序和生物信息學分析由藥明康德公司(WuXi AppTec)完成。外顯子捕獲和建庫測序采用SureSelect_Human_Exon_V5試劑盒(Agilent Technologies，Santa Clara，USA)和HiSeq 2500測序平臺(Illumina，San Diego，USA)。根據生信分析結果和美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)遺傳變異分類標準與指南，挑選候選基因和突變進行致病性評級[11]。家系3患者就診時攜帶外院進行的二代測序報告。

1.3 基因突變的驗證

首先，通過Sanger測序確認全外顯子組測序得到的候選突變是否存在。其次，采用限制性片段長度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)對家系內成員進行共分離驗證，并驗證候選突變是否存在于200例正常人對照中。CHM基因的c.186C>G突變會破壞SexAⅠ的酶切位點。通過一對引物(F：5′-TTGGGATCTGAGAGGCCTACT-3′，R：5′-CGCACCCGAGCTC-TATTTATAT-3′)擴增包含突變位點的CHM基因片段，再用限制性內切酶SexAⅠ(New England BioLabs)對PCR產物進行酶切(37℃，4 h)，DNA凝膠電泳觀察條帶大小變化。

2 結果

2.1 家系圖與一般特征

本研究招募的3個家系的成員關系見圖1。家系1納入3名男性患者。患者Ⅱ-1，10歲左右出現夜盲癥狀，約20歲時在外院接受抗青光眼手術治療，來院就診時有嚴重白內障且拒絕手術治療，無法進行眼底檢查，故本研究排除該患者。家系1中Ⅱ-3、Ⅱ-5的父母均無夜盲或視力下降癥狀，而Ⅲ-4的父母也表現正常，提示遺傳方式可能為X連鎖隱性遺傳(圖1A)。家系2、3各納入1名第3代男性患者；而家系2、3的患者Ⅱ-1均有夜盲癥狀和視力障礙，初步判定為患者，但在外院就診，未進行詳細的眼科檢查，故未納入本研究。家系2、3遺傳方式與家系1類似(圖1B、1C)。三家系中均無近親結婚史。納入的5例患者初診年齡22～49歲，初診中位數年齡39歲。

A:家系1;B:家系2;C:家系3;'□：正常男性；○：正常女性；■：男性患者；⊙：女性攜帶者；↑：先證者圖1 X連鎖視網膜變性家系圖譜Fig.1 Maps of X-linked retinal degeneration families

2.2 患者臨床表現

2.2.1 視力 所有5例患者均從10歲左右開始出現夜盲，部分患者逐漸出現中心視力下降。5例10眼均接受了BCVA檢查?；颊連CVA介于0.02～0.60之間(小數視力)，其中80%患眼視力≥0.5，明顯好于之前關于國人報道中的平均視力0.28[8]。值得注意的是，家系1的Ⅱ-3、Ⅱ-5患者初診時均存在晶體后極部局限性皮質渾濁，未接受手術治療。家系1的3名患者隨訪5年視力均無明顯變化。家系2的1名患者于2021年復診，隨訪半年，視力無明顯變化。家系3患者雙眼視力0.6。

2.2.2 眼底改變 家系1先證者Ⅱ-5眼底檢查顯示雙眼視盤邊界清晰，視網膜色素上皮及脈絡膜毛細血管層廣泛萎縮、消失，導致脈絡膜大血管層和鞏膜暴露，中周部視網膜有骨細胞樣色素沉積(圖2A)，雙眼黃斑中心凹反光消失。患者Ⅱ-3的左眼黃斑灰白色隆起，右眼與先證者類似；患者Ⅲ-4的眼底情況好于先證者(圖2A)。女性攜帶者Ⅰ-2未見明顯眼底異常(圖略)，Ⅱ-8見廣泛椒鹽狀脫色素改變(圖2A)。

家系2患者眼底所見與上述患者基本一致；雙眼萎縮性改變及色素沉積波及黃斑區(qū)，較家系1患者程度更嚴重；且其右眼黃斑大片視網膜下白色脈絡膜新生血管(CNV)性增殖膜(圖2B)。家系3患者眼底見雙眼萎縮性及色素沉積波及黃斑區(qū)，鞏膜暴露更明顯，余與上述患者類似(圖2C)。家系1和家系2的4名患者于2021年復診，眼底均無明顯變化。

A：家系1中患者Ⅱ-5和Ⅲ-4眼底中周部可見暴露的大血管和鞏膜以及片狀色素沉積，攜帶者Ⅱ-8周邊視網膜可見大量的椒鹽狀脫色素改變；B：家系2先證者Ⅲ-2眼底可見嚴重的視網膜色素上皮和脈絡膜萎縮、大量片狀色素沉積以及右眼黃斑區(qū)視網膜下脈絡膜新生血管性增殖膜；C：家系3先證者Ⅲ-2眼底可見嚴重的視網膜色素上皮和脈絡膜萎縮，色素沉積及鞏膜暴露；OD：右眼；OS：左眼圖2 彩色眼底照片Fig.2 Color fundus photographs

2.2.3 SD-OCT下的形態(tài)改變 家系1先證者Ⅱ-5的SD-OCT結果顯示右眼黃斑保留相對完整的視網膜層次和結構，但外叢狀層與外核層間出現微小的黃斑囊樣病變(cystoid macular lesion，CM)及外層視網膜管狀結構(outer retinal tubulation，ORT)；外核層在黃斑區(qū)保留的情況相對好于周邊區(qū)域；黃斑中心凹以外的區(qū)域可以觀察到突然丟失的外層視網膜以及脈絡膜顯著變薄和對應處鞏膜反射信號的增強(圖3A)。患者Ⅱ-3右眼中心視網膜厚度約為295 μm，左眼可見嚴重的大面積橢圓形全層視網膜囊樣病變(橫徑約12 mm，豎徑約6 mm，中心視網膜厚度約1000 μm)(圖3B)?；颊撷?4的SD-OCT表現與先證者右眼類似。先證者母親Ⅰ-2和妹妹Ⅱ-8雙眼黃斑結構正常(圖略)。

A：家系1先證者Ⅱ-5右眼黃斑區(qū)SD-OCT掃描圖，黃斑區(qū)見囊樣改變(白色箭頭)，中心凹外見外層視網膜管狀結構(紅色箭頭)，黃斑中心凹以外可以觀察到突然丟失的外層視網膜以及脈絡膜顯著變薄和對應處鞏膜反射信號的增強(黃色箭頭)；B：家系1患者Ⅱ-3左眼黃斑區(qū)SD-OCT掃描圖，左眼出現大面積波及全層視網膜的囊樣病變；C：家系2先證者Ⅲ-2雙眼SD-OCT圖，右眼見視網膜下CNV性高反射團；OD：右眼；OS：左眼圖3 患者的SD-OCT表現Fig.3 SD-OCT presentation of the patients

家系2先證者Ⅲ-2的SD-OCT結果顯示右眼黃斑中心凹區(qū)域存在明顯視網膜下CNV性增殖膜，左眼黃斑結構相對完整，雙眼萎縮性改變與家系1患者改變類似(圖3C)。家系3患者雙眼見萎縮性改變與上述患者類似(圖略)。

所有10只眼，8只(80%)可見不同程度黃斑囊樣病變，其中7眼為微小病變。7眼(70%)可見ORT改變，且大部分位于黃斑中心凹以外伴有RPE萎縮的區(qū)域?；颊吲R床資料匯總見表1。

表1 患者臨床資料Table 1 The clinical data of patients

2.3 致病基因和突變鑒定

3個家系均不存在近親婚史，且都存在父母視力正常而子女發(fā)病的情況?；颊呔鶠槟行?，而其女性同胞(姐妹)均不發(fā)病。結合家系圖和患者的臨床表現，我們對3個家系的初步診斷為X連鎖隱性遺傳的視網膜色素變性或無脈絡膜癥。

對于家系1，在排除X連鎖RP致病基因RPGR和RP2后，我們對先證者Ⅱ-5進行了全外顯子組測序和生物信息學分析，共發(fā)現6個位于X染色體上的候選突變(CHM c.186C>G；AKAP4 c.2191G>C；TSC22D3 c.472C>T；SHROOM2 c.4541A>C；ARMCX6 c.131G>A；ARMCX6 c.333T>A)。經過Sanger測序驗證(圖4A)和家系內共分離分析(圖4B)，最后確定CHM為該家系致病基因。CHM基因的c.186C>G突變是一個未見報道的無義突變，可導致CHM基因第62位酪氨酸密碼子TAC轉變?yōu)榻K止密碼子TAG，產生一個含61 aa的截短蛋白(p.Tyr62*)。家系中有夜盲癥狀者均為男性且攜帶該突變，先證者母親Ⅰ-2和妹妹Ⅱ-8為該突變的攜帶者(圖4B)。

對于家系2，我們直接對CHM基因進行了Sanger測序，結果發(fā)現了一個CHM基因的c.189+1G>A突變(圖4C)。該突變是一個剪接位點突變，曾經在一個西班牙家系中報道過[12]，可導致3號外顯子跳躍，產生一個含44 aa的截短蛋白，具有明確的致病性。

A：家系1先證者Ⅱ-5存在c.186C>G突變(黑色下劃線)；B：CHM基因突變在家系1中的共分離分析，正常人為2個較小條帶，患者只有1條未切開條帶，攜帶者則為3個條帶；C：家系2先證者Ⅲ-2存在c.189+1G>A剪接位點突變(紅色箭頭)圖4 CHM基因突變位點驗證Fig.4 Verification of CHM gene mutation site

家系3患者就診時已進行了全外顯子組測序。通過查閱測序報告，發(fā)現了一個CHM基因的c.808 C>T突變。該突變曾在一個中國人家系中報道過[7]，為無義突變，可導致翻譯在第270位密碼子處提前終止，具有明確的致病性。根據遺傳學分析結果3個家系最終均確診為無脈絡膜癥。

3 討論

無脈絡膜癥是一種X染色體連鎖的遺傳性脈絡膜視網膜退化疾病，主要癥狀包括夜盲、漸進性視野收縮、視力下降和畏光。由于視網膜色素上皮層、外層視網膜、脈絡膜血管層的漸進性萎縮，患者眼底暴露出白色鞏膜和深層脈絡膜血管[13]。由于發(fā)病率低，國內罕有大宗病例研究。韓筱煦等[8]報道了一項包含10例患者的研究，提示中國CHM患者的平均視力為0.28，35歲以上患者70%眼的視力低于0.5，且病情進展更快。與上述研究不同的是，本研究納入的患者視力大部分大于0.5，即使在有白內障存在的情況下也明顯好于此前國人的報道，并且3例患者隨防5年視力無明顯惡化。國外的一些大宗病例報道，如Heon等[14]基于60例患者的研究發(fā)現，30歲以下患者的視力與正常人比較，差異無統(tǒng)計學意義；50歲以上患者的視力明顯低于0.62(小數視力)。Freund等[15]基于128例患者的研究發(fā)現，40歲以下患者視力基本正常。本研究與國外的這些大宗病例報道結論較為一致，而與國人的報道有所不同。但由于本研究樣本量過小，還需要進一步擴大樣本量進行跟蹤研究。

黃斑囊樣病變是CHM常見的SD-OCT改變。本研究中CHM患者黃斑囊樣病變的發(fā)生率為80%，大部分患眼該改變僅限于外層視網膜且程度較輕，僅1眼可見囊樣改變波及節(jié)細胞層。此外，家系1患者中有1眼黃斑區(qū)存在大面積的嚴重囊樣病變，是導致其視力低下的重要原因。這一現象此前在中國CHM患者中未見詳細報道[7-8]，但我們觀察到的發(fā)生率與國外報道相近。如，Murro等[16]的一項包括42例患者的回顧性研究，發(fā)現38%的患者(34.7%患眼)有此改變。Genead等[17]的研究報道了一組16例患者，發(fā)現70%的患眼有不同程度的黃斑囊樣病變。這一現象之前也在視網膜色素變性等遺傳性視網膜變性類疾病中被報道，其具體發(fā)病機制還不明確，可能與血-視網膜屏障功能異常，視網膜色素上皮細胞的功能障礙等有關[18]。由于這一現象發(fā)生率很高，對患者進行定期復查一旦發(fā)現視網膜厚度增加，可考慮給予碳酸酐酶抑制劑治療[18]，有可能阻止患者視力進一步下降。

ORT指位于視網膜外層的、環(huán)以高反射信號邊緣的、圓形或卵圓形低反射信號空腔。本研究納入的5名患者10眼ORT的發(fā)生率為70%，其部位多位于黃斑中心凹以外伴有視網膜色素上皮萎縮的區(qū)域，與之前關于國人的研究結果類似[8]。Murro等[16]也曾在15/18(83.3%)患者中觀察到此現象。ORT是Bietti結晶樣視網膜變性、視網膜色素變性等變性類疾病晚期的標志[19-20]，通常被認為是變性的光感受器在鄰近視網膜色素上皮和膠質細胞的影響下發(fā)生的重排[20]。但是這一改變與患者視力、疾病進展等方面的關系還有待進一步研究。

本研究中家系2先證者右眼黃斑區(qū)視網膜色素上皮與脈絡膜之間存在高反射團，結合病史考慮為繼發(fā)脈絡膜新生血管，是此眼視力低下的主要原因。有文獻報道1例CHM患者發(fā)生CNV引起嚴重的視力下降，但是半年后發(fā)生自發(fā)消退，視力恢復到0.8[21]。也有報道，抗VEGF藥物貝伐單抗可以有效治療繼發(fā)性CNV[22]。然而，本例患者就診時CNV已經呈視網膜下疤痕樣改變，無黃斑區(qū)出血或水腫等活動性病變，失去治療價值。CNV也見于其他多種視網膜變性類疾病[21]，是視力嚴重下降的重要原因。定期復查，及時發(fā)現和治療這類并發(fā)癥顯得非常重要。

CHM是目前已知的X連鎖隱性遺傳無脈絡膜癥的唯一致病基因[13]，目前已有300多個CHM基因突變被報道，包括錯義、無義、剪接等突變類型(Human Gene Mutation Database，http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)，其中以無義突變出現的頻率最高。本研究中發(fā)現的CHM基因新突變(c.186C>G，p.Tyr62*)屬于無義突變，但由于十分接近剪接位點，也可能引起pre-mRNA剪接的改變[23]，突變導致REP-1蛋白的翻譯在非?？壳暗奈恢媒K止，無法產生有功能的蛋白。本研究家系2發(fā)現的剪接突變(c.189+1G>A，)曾見于報道，但在中國人群中是首次發(fā)現。家系3的突變?yōu)闊o義突變(c.808C>T)，在中國人群已有報道。3個突變均會導致CHM蛋白的截短，從而無法行使正常功能，導致未修飾的Rab蛋白錯誤累積并影響細胞蛋白質的轉運，最終引起感光細胞、視網膜色素上皮和脈絡膜的進行性變性[6]。根據ACMG致病性評級指南，這3個突變均可確定為致病性突變。

綜上所述，本文報道了3個中國無脈絡膜癥家系的臨床特征和遺傳病因。該研究拓寬了CHM基因的突變譜，提示黃斑萎縮性改變、嚴重的黃斑囊樣病變或脈絡膜新生血管是無脈絡膜癥患者中心視力下降的常見原因,為今后的遺傳咨詢和基因治療奠定了基礎。