朱嶺峰， 吳海洋， 章雪瑜， 朱宇清

（1.深圳昭藍檢測實驗室，廣東 深圳 518000；2.上?？迫A生物工程股份有限公司，上海 200233；3.上海市臨床檢驗中心，上海 200126）

2019年，中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）發(fā)布了CNASGL037《臨床化學(xué)定量檢驗程序性能驗證指南》，推薦采用多項回歸分析來驗證線性區(qū)間。而最為醫(yī)學(xué)實驗室所熟知的多項回歸分析驗證線性區(qū)間的文件分別為WS/T 408-2012《臨床化學(xué)設(shè)備線性評價指南》（簡稱WS/T 408—2012）和美國臨床實驗室標準化學(xué)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2003年發(fā)布的 EP06-A文件，2個文件要求的線性區(qū)間驗證的實驗設(shè)計、樣本制備與測定等具體操作步驟沒有明顯差別。但當實驗數(shù)據(jù)呈現(xiàn)非線性關(guān)系時，對于臨床可接受允許偏差的計算方式完全不同，WS/T 408—2012要求評估整個稀釋范圍的非線性程度，CLSI EP06-A文件要求評估每個稀釋濃度的非線性程度。

WS/T 408—2012介紹的方法由KROLL等[1]提出，并在美國病理學(xué)家協(xié)會（the College of American Pathologists，CAP）的校準驗證和線性評估（calibration verification and linearity program，CVL）中使用多年；CLSI EP06-A文件在CLSI EP06-P文件和CAP線性評價的基礎(chǔ)上，經(jīng)過不斷實踐和經(jīng)驗總結(jié)，被認為是目前最好的線性評價方法[2]。但無論是WS/T 408—2012，還是EP06-A文件，在醫(yī)學(xué)實驗室實際使用的過程中均仍然存在一些問題。本文以驗證雌二醇（estradiol，E2）項目的線性范圍為例進行分析。

收集足量高值（H）、低值（L）2份標本，按L、0.8L+0.2H、0.6L+0.4H、0.4L+0.6H、0.2L+0.8H、H配制成6個不同濃度的系列樣品，每個樣品在某化學(xué)發(fā)光儀上隨機測定3次，在1 d內(nèi)完成。結(jié)果記錄見表1。

表1 E2實驗結(jié)果

首先確定實驗方法可接受的不精密度、線性偏差或非線性程度的允許誤差范圍，該項目的線性偏差均設(shè)定為1/3 允許總誤差（allowable total error，TEa）。目測有無明顯離群值，如有，查找原因并解決。

采用多項式回歸分析，計算不精密度（WS/T 408—2012與CLSI EP06-A文件中關(guān)于驗證精密度的內(nèi)容不同，但本研究不做討論），符合要求后，將測定數(shù)據(jù)分別擬合一次多項式（b0+b1X）、二次多項式（b0+b1X+b2X2）和三次多項式（b0+b1X+b2X2+b3X3），根據(jù)t值判斷擬合曲線的非線性系數(shù)（b2和b3）與0的差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義，如有，則判斷為非線性；無，則為線性。當存在非線性時，以回歸分析標準誤最小者為最適多項式。

當初步判斷為非線性時，按WS/T 408—2012要求計算最優(yōu)擬合曲線與直線的平均差異值（average deviation from linearity，ADL），計算公式為：

式中P（x）為最適多項式在每個稀釋濃度處的估計值，b0+b1X為擬合線性（直線）模型在每個濃度處的估計值，n為樣本數(shù)與測定次數(shù)的乘積，為所有測定濃度測量數(shù)據(jù)的平均值。ADL應(yīng)小于查表獲得的ADL臨界值，否則判斷為臨床不可接受的非線性。統(tǒng)計結(jié)果見表2、表3、圖1。

表2 多項回歸分析結(jié)果

表3 非線性程度判斷（WS/T408—2012）

圖1 E2多項回歸線性擬合圖

當初步判斷為非線性時，按CLSI EP06-A文件要求計算線性偏差，計算公式為：DLi=P（x）-（b0+b1x），式中P（x）為最適多項式在每個稀釋濃度處的估計值，b0+b1X為擬合線性（直線）模型在每個濃度處的估計值。每個點DLi均應(yīng)小于設(shè)定誤差，否則判斷為臨床不可接受的非線性。如需要換算成百分比，則將每DLi÷該濃度的測量均值，再×100%。統(tǒng)計結(jié)果見表4、圖1。

表4 非線性程度判斷（CLSI EP06-A文件）

可以看到，按照不同的文件要求計算同一實驗數(shù)據(jù)，得到的結(jié)論截然相反。為了得到更為直觀的結(jié)論，可以按照平均斜率法和逐步直線回歸統(tǒng)計法[3]處理數(shù)據(jù)。統(tǒng)計結(jié)果見表5、圖2。

圖2 E2平均斜率法回歸圖

表5 平均斜率法和逐步直線回歸統(tǒng)計結(jié)果

通過逐步直線回歸統(tǒng)計可以發(fā)現(xiàn)，從第4個點開始斜率已經(jīng)不符合平均斜率法的要求（b1=1±0.03），所以判斷該范圍內(nèi)呈非線性。按WS/T 408—2012的方法，該項為臨床可接受的非線性；而按CLSI EP06-A文件的方法，則為臨床不可接受的非線性。但是通過平均斜率法進行直觀的判斷，可以發(fā)現(xiàn)該項目為非線性。

盡管WS/T408—2012也提到參考CLSI EP06-A文件，采用了多項式法進行線性評價，但對非統(tǒng)計學(xué)線性的情況進行臨床線性的評估則是采用KROLL等[1]提出的最優(yōu)擬合曲線與直線的平均差異值，即ADL。從ADL計算公式中可以發(fā)現(xiàn)，其反映的是最優(yōu)擬合曲線與直線離散程度，因為該公式的模型就是標準差公式的模型，所以WS/T408—2012評估的是全部稀釋范圍的非線性程度，個別稀釋濃度點的非線性由于計算ADL而被忽略了[4]，這一方案也被CAP運用于其線性評估和校準驗證的調(diào)查。

CLSI EP06-A文件的線性評價方法也存在不足：（1）計算線性偏差時是采用最適多項式與直線回歸（并非測量均值）估計值的差值來表達，但是偏差的目標并未明確，僅要求實驗室必須確定自己的測量誤差目標；（2）直線回歸對于呈曲線表示的數(shù)據(jù)時，降低了斜率，又增加了截距，往往使低濃度的數(shù)據(jù)點常處在回歸直線之下，直線回歸線上的估計值明顯偏高，導(dǎo)致有些數(shù)據(jù)點的最適多項式與直線回歸估計值的差異過高，得出非線性的結(jié)論。

在CAP的介紹中可發(fā)現(xiàn)，目前的CVL的調(diào)查相較于WS/T408—2012有了較大的變化：（1）修改了偏差的目標；（2）增加了各個稀釋點的非線性的判斷。在方法評估中，公認的做法是指定TEa，并按比例分配總誤差用于偏差的目標，通常，在CVL調(diào)查中，1/2TEa用于校準驗證，1/4TEa用于線性評估[5]。同時，在計算ADL的基礎(chǔ)上，增加了對每個檢測值與最適直線回歸的差值計算，并且要求差值＜1/4TEa。

綜上所述，合適的線性范圍既可以反映該范圍內(nèi)檢測結(jié)果真實的比例關(guān)系，也可避免不必要的稀釋操作，是僅次于精密度的重要指標。臨床實驗室應(yīng)認識到實驗室數(shù)據(jù)是第1位的，任何統(tǒng)計方法都可能因存在缺陷而產(chǎn)生錯誤的結(jié)論。臨床實驗室質(zhì)量管理職能部門除組織常規(guī)的能力驗證活動外，也可以嘗試提供線性驗證和校準驗證的調(diào)查，以便更全面地反映實驗室各檢測系統(tǒng)的檢測水平，提高檢測質(zhì)量，更好地為臨床診斷服務(wù)。