王偉，于亮，王志，王偉偉，鈕力亞，陸莉，王奉芝，張景儉

(滄州市農(nóng)林科學(xué)院/河北省農(nóng)作物耐鹽堿評(píng)價(jià)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 滄州 061001)

土壤鹽漬化是當(dāng)前世界上最難解決的資源環(huán)境問(wèn)題之一[1]，而干旱半干旱地區(qū)的土壤鹽堿化日益嚴(yán)重[2-3]。鹽漬化土壤在世界范圍內(nèi)分布廣泛，世界各地鹽堿化的土壤總面積高達(dá)8.31×109hm2，我國(guó)鹽漬化的土壤面積近1 億hm2，其中河北省鹽堿地總面積約71.61 萬(wàn)hm2，約占耕地總面積的10%。其中，滄州市是河北省乃至全國(guó)濱海鹽堿地集中的主要地區(qū)之一[4-6]。研究、開(kāi)發(fā)和利用鹽漬化土壤對(duì)保護(hù)耕地資源、保障國(guó)家糧食安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

培育耐鹽堿植物新品種和提高植物耐鹽堿能力是鹽堿地生物改良的有效途徑。篩選和鑒定耐鹽堿種質(zhì)資源是培育耐鹽堿植物新品種的重要基礎(chǔ)。植物種類(lèi)不同，耐鹽堿能力的鑒定方法也不同。即使同一植物種類(lèi)，不同研究人員采用的鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)也有所不同。目前主要有單鹽(NaCl)脅迫鑒定[7-8]、多種鹽分配比脅迫鑒定[9-10]和人工海水配方脅迫鑒定[11-12]等方法，且這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。如人工海水配方脅迫鑒定方法雖然鹽分離子較為全面，但與實(shí)際自然環(huán)境下鹽堿地土壤離子組成仍有較大差異。生產(chǎn)上迫切需要一種可室內(nèi)操作、快速、高效的、貼近自然環(huán)境中鹽堿地鹽分離子實(shí)際的配方，以用于植物耐鹽堿鑒定與評(píng)價(jià)。

目前，關(guān)于土壤鹽分離子檢測(cè)的數(shù)據(jù)與分析均是基于樣本檢測(cè)的結(jié)果，受取樣時(shí)間、取樣地點(diǎn)、取樣土層等影響[13-14]，不能完全準(zhǔn)確地反映取樣地區(qū)鹽分離子含量的總體情況。本研究基于滄州濱海鹽堿區(qū)的鹽分離子檢測(cè)數(shù)據(jù)，采用多變量重抽樣自舉法[15-16]，利用計(jì)算機(jī)模擬抽樣，綜合推斷滄州濱海鹽堿地主要鹽分離子的總體含量，然后依據(jù)陰陽(yáng)離子電荷平衡，建立代表自然環(huán)境下輕度、中度、重度鹽堿地鹽分的化學(xué)試劑配方(簡(jiǎn)稱(chēng)人工鹽堿地配方)，并采用小麥芽期鹽堿耐性鑒定試驗(yàn)驗(yàn)證配方的科學(xué)性和有效性，以期為建立快速、高通量的室內(nèi)植物耐鹽堿鑒定與評(píng)價(jià)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 土樣采集與檢測(cè)方法

于2019 年河北滄州地區(qū)的“返鹽”季節(jié)分別在濱海的鹽山、黃驊、中捷、海興4 地典型的鹽堿地上分3 個(gè)批次取樣。每次取樣時(shí)間間隔約40 d，分別為3 月21 日至3 月25 日、4 月1 日至4 月5 日、5月11 日至15 日。采用5 點(diǎn)取樣法，利用土鉆分別采取0～20、20～40、40～60、60～80、80～100 cm 5 個(gè)土層的土壤。鹽山設(shè)4 次重復(fù)，其他取樣地點(diǎn)設(shè)3次重復(fù)。采集完后立刻帶回實(shí)驗(yàn)室自然陰干，然后將各土樣混合均勻后過(guò)篩，用于鹽分離子檢測(cè)。

采用電導(dǎo)法[17]測(cè)定土壤可溶性總鹽含量；用pH 計(jì)測(cè)定土樣pH 值；采用火焰分光光度計(jì)法測(cè)定鉀離子、鈉離子含量[18]。土樣進(jìn)行相應(yīng)前處理后，采用AA3 流動(dòng)分析儀進(jìn)行土壤總含鹽量及各主要鹽分離子含量的測(cè)定，包括碳酸根+碳酸氫根離子、鈉離子、鎂離子、氯離子、鈣離子、硅酸根和硫酸根離子。

1.2 多變量重抽樣自舉的實(shí)現(xiàn)方法

根據(jù)莫惠棟的重抽樣技術(shù)——自舉法[16]，綜合考慮各鹽分離子間的相互關(guān)系，實(shí)現(xiàn)各鹽分離子含量的重抽樣自舉。其主要步驟如下:

Step1:將195 個(gè)樣本編碼為1～195 號(hào)，共195組數(shù)據(jù)。

Step2:重抽樣自舉樣本。抽1～195 的隨機(jī)數(shù)字，將抽到樣本的所有指標(biāo)的數(shù)據(jù)作為自舉樣本的一組觀察值。循環(huán)抽樣195 次(n=195)，獲得的195 組數(shù)據(jù)構(gòu)成一個(gè)新的自舉樣本。

Step3:將新的自舉樣本按輕度、中度、重度鹽堿地的總含鹽量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)，獲得該樣本的輕度、中度和重度鹽堿地的其他各個(gè)指標(biāo)的平均數(shù)。

Step4:重復(fù)第2 和第3 步，循環(huán)重抽樣10 000次，獲得10 000 個(gè)重抽樣自舉樣本的輕度、中度和重度鹽堿地(3 種類(lèi)型)各指標(biāo)的平均數(shù)。

Step5:計(jì)算10 000 個(gè)重抽樣自舉樣本各指標(biāo)平均數(shù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.3 試驗(yàn)材料和小麥芽期耐鹽堿鑒定方法

選擇16 個(gè)常規(guī)小麥品種作為試驗(yàn)材料(表1)，以超純水為對(duì)照，設(shè)置輕度、中度、重度3 個(gè)鹽分水平的鹽堿地配方，分別進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。在培養(yǎng)皿中放兩層濾紙，分別加入去離子水(對(duì)照)和鹽分溶液，每個(gè)處理30 粒種子，3 次重復(fù)。置于光照培養(yǎng)箱發(fā)芽(25 ℃恒溫，光照16 h)。7 d 后調(diào)查發(fā)芽率，隨機(jī)挑選10 株幼苗調(diào)查芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根數(shù)、芽鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量及根冠比，并計(jì)算各性狀的相對(duì)值。計(jì)算公式為:性狀相對(duì)值=鹽堿脅迫下性狀值/對(duì)照條件下性狀值[19]。

表1 試驗(yàn)采用的小麥品種和來(lái)源Table 1 Varieties and sources of the wheat cultivate used in the experiment

采用隸屬函數(shù)法，利用主成分分析和聚類(lèi)分析進(jìn)行小麥芽期鹽堿耐性評(píng)價(jià)[19-20]。根據(jù)各試驗(yàn)材料各指標(biāo)的相對(duì)值，采用主成分分析獲得各材料的因子得分后，通過(guò)隸屬函數(shù)法對(duì)各試驗(yàn)材料因子得分進(jìn)行分析，獲得衡量各材料鹽堿耐性強(qiáng)弱的D值，再采用K-均值聚類(lèi)方法對(duì)各材料的D值進(jìn)行聚類(lèi)，將供試材料的鹽堿耐性分為髙耐、耐鹽、中耐、敏感、高感5 個(gè)級(jí)別。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工模擬鹽堿地鹽分配方的建立

2.1.1 歸類(lèi)和重抽樣自舉

按照輕度鹽堿地(總含鹽量小于0.3%)、中度鹽堿地(總含鹽量介于0.3%～0.6%之間)和重度鹽堿地(總含鹽量超過(guò)0.6%)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類(lèi)，分別形成輕度、中度和重度鹽堿地各離子的樣本數(shù)據(jù)。再采用多變量自舉法，利用Python3.7.4實(shí)現(xiàn)重抽樣自舉，估計(jì)出輕度、中度和重度3 類(lèi)濱海鹽堿地各鹽分離子總體的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤(表2)。最后，根據(jù)陰陽(yáng)離子電荷平衡，組合形成輕度、中度、重度人工鹽堿地鹽分配方(表3)。

表2 基于重抽樣自舉法的各鹽分離子的參數(shù)估計(jì)Table 2 The parameter estimates of salt ions based on resampling bootstrap method

表3 人工模擬鹽堿地鹽分配方Table 3 The artificial simulated formula of the salts from the saline alkali soilg·L-1

2.1.2 人工模擬鹽堿地鹽分溶液的制備

取約800 mL 超純水，依次加入表3 中相應(yīng)含量的各試劑，待充分溶解后，用容量瓶定容至1 000 mL，形成類(lèi)似于自然環(huán)境條件下輕度、中度和重度濱海鹽堿地鹽分的溶液。應(yīng)用中必須注意的是，該溶液長(zhǎng)時(shí)間靜置容易產(chǎn)生少量沉淀，需現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 人工模擬鹽堿地鹽分配方在小麥芽期耐鹽堿鑒定中的應(yīng)用

2.2.1 小麥芽期耐鹽堿鑒定中鹽分水平的選擇

為了驗(yàn)證本研究中的配方在植物鹽堿耐性鑒定中的可行性和有效性，需要采用F測(cè)驗(yàn)進(jìn)行方差分析。方差分析結(jié)果表明(表4)，除根鮮質(zhì)量外，對(duì)照與輕度、中度和重度鹽堿地的模擬配方在發(fā)芽率、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根數(shù)、芽鮮質(zhì)量和根冠比6 個(gè)指標(biāo)上均存在極顯著差異(P＜0.01)。

表4 小麥芽期耐鹽堿鑒定指標(biāo)的方差分析結(jié)果Table 4 The analysis of variance for the traits of wheat for the salt and alkali tolerance at germination stage

采用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較(表5)，根據(jù)多重比較結(jié)果確定小麥芽期鹽堿耐性鑒定的鹽分水平。

表5 處理間的多重比較結(jié)果Table 5 The multiple comparisons between the treatments

輕度鹽堿地模擬配方與對(duì)照在發(fā)芽率、根數(shù)、根冠比指標(biāo)上均存在顯著或極顯著差異。中度和重度鹽堿地模擬配方與對(duì)照在發(fā)芽率、芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、根數(shù)和根冠比5 個(gè)指標(biāo)上均存在顯著或極顯著差異，而中度和重度鹽堿地模擬配方僅在根數(shù)、根鮮質(zhì)量和根冠比上差異不顯著。根據(jù)表2 可知，輕度、中度和重度鹽堿地鹽分配方的總含鹽量平均值分別為1.149 1、3.832 1 和7.754 1 g/kg。根據(jù)小麥耐鹽堿鑒定時(shí)自然條件下田間鹽堿地的實(shí)際情況，結(jié)合趙松山等[5]在田間及模擬鹽池中關(guān)于小麥耐鹽性鑒定的經(jīng)驗(yàn)，綜合確定實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行小麥芽期鹽堿耐性鑒定時(shí)采用中度鹽堿地鹽分配方較為合適。

2.2.2 小麥芽期鹽堿耐性鑒定結(jié)果

以主成分分析獲得的3 個(gè)主成分因子作為鑒定小麥芽期鹽堿耐性的綜合指標(biāo)，計(jì)算各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值及權(quán)重，進(jìn)而得到各材料芽期的鹽堿耐性綜合評(píng)價(jià)值(D)，D值越大，鹽堿耐性越強(qiáng)。采用K-均值聚類(lèi)方法將供試材料的鹽堿耐性分為髙耐、耐鹽、中耐、敏感、高感5 個(gè)級(jí)別(表6)。鑒定結(jié)果:農(nóng)家種滄紅和茶淀紅的耐鹽堿等級(jí)為1 級(jí)(高耐)；滄麥6002、滄麥6005、冀麥32、科遺26、輪抗6 和輪抗7 的耐鹽堿等級(jí)為2 級(jí)(耐鹽)；濟(jì)麥22、石麥22、晉麥47 和山融3 號(hào)的耐鹽堿等級(jí)為3 級(jí)(中耐)；科農(nóng)9204 和中國(guó)春的耐鹽堿等級(jí)為4 級(jí)(敏感)；衡4399 和矮抗58 的耐鹽堿等級(jí)為5 級(jí)(高感)。

表6 小麥芽期鹽堿耐性鑒定結(jié)果Table 6 Identification of salt and alkali tolerance of wheat at germination stage

3 討論

3.1 關(guān)于重抽樣自舉法的應(yīng)用

自舉法是現(xiàn)代統(tǒng)計(jì)學(xué)研究中的一種重抽樣技術(shù)，依賴(lài)于計(jì)算機(jī)的大容量和高效率進(jìn)行相應(yīng)統(tǒng)計(jì)數(shù)的估計(jì)[15-16]。因?yàn)橥寥利}分離子間存在這樣或那樣不同程度的相互關(guān)聯(lián)，如果利用樣本單個(gè)鹽分離子的檢測(cè)數(shù)據(jù)估計(jì)其總體的參數(shù)易出現(xiàn)誤差。本研究首次將自舉法應(yīng)用到土壤離子成分的構(gòu)成分析。在滄州濱海鹽堿地土樣檢測(cè)的樣本數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用多變量重抽樣自舉法[16]和Python 語(yǔ)言，利用計(jì)算機(jī)模擬對(duì)樣本資料進(jìn)行復(fù)置抽樣，產(chǎn)生一系列新的能夠代表被研究總體的多個(gè)樣本，進(jìn)而模擬出統(tǒng)計(jì)數(shù)的分布，估計(jì)輕度、中度和重度鹽堿地上主要鹽分離子的總體參數(shù)。同時(shí)，根據(jù)陰陽(yáng)離子電荷平衡，組配出貼近自然環(huán)境實(shí)際的輕度、中度和重度鹽堿地鹽分的化學(xué)試劑配方。

3.2 關(guān)于人工模擬鹽堿地鹽分配方的特點(diǎn)

本研究在滄州濱海鹽堿地主要鹽分離子檢測(cè)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，首先利用多變量重抽樣自舉法估計(jì)出各主要鹽分離子的總體含量，然后根據(jù)土壤中陰陽(yáng)離子電荷平衡組配化學(xué)試劑，形成了人工模擬鹽堿地鹽分配方。這3 種模擬配方含有8 種鹽分離子，比NaCl 脅迫鑒定[7-8]、多種鹽分配比脅迫鑒定[9-10]和人工海水配方脅迫鑒定[11-12]中的鹽分離子更全面。而且通過(guò)重抽樣自舉法對(duì)配方中的離子含量實(shí)現(xiàn)參數(shù)估計(jì)，相當(dāng)于采用大量的實(shí)際鹽分離子檢測(cè)數(shù)據(jù)，更貼近自然環(huán)境下濱海鹽堿地的實(shí)際鹽分含量。

3.3 關(guān)于人工模擬鹽堿地鹽分配方的應(yīng)用

采用本研究中的人工模擬鹽堿地鹽分配方，可以在室內(nèi)快速實(shí)現(xiàn)植物鹽堿耐性的鑒定工作。小麥芽期鹽堿耐性鑒定試驗(yàn)結(jié)果表明，中度鹽堿地的模擬配方適宜作為小麥芽期鹽堿耐性鑒定的鹽分水平。其中，滄紅和茶淀紅是較為耐鹽的農(nóng)家種，本研究鑒定的等級(jí)與田間實(shí)際相符；滄麥6002、滄麥6005、冀麥32 的耐鹽堿等級(jí)鑒定為耐鹽，與相關(guān)研究結(jié)果基本吻合[19，21]；中國(guó)春、科農(nóng)9204 和衡4399是常規(guī)意義上的不耐鹽堿小麥材料，在本研究中鑒定為敏感或高感。另外，晉麥47 和山融3 號(hào)在本研究中的鑒定等級(jí)與相關(guān)報(bào)道有一定差異[22]，可能是由于本研究目前僅限于小麥芽期鹽堿耐性的鑒定結(jié)果，如果對(duì)小麥全生育期的鹽堿耐性進(jìn)行鑒定，也有可能與芽期的耐鹽鑒定結(jié)果不一致。綜上，采用本研究配方對(duì)小麥的芽期鹽堿耐性的鑒定結(jié)果與相關(guān)的實(shí)踐或文獻(xiàn)資料基本吻合，在一定程度上說(shuō)明該配方的可行性和有效性。另外，在其他植物鹽堿耐性的鑒定上，此人工模擬鹽堿地鹽分配方的可行性和有效性則有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，通過(guò)多變量重抽樣自舉法可以實(shí)現(xiàn)滄州濱海鹽堿地主要鹽分離子含量的參數(shù)估計(jì)。根據(jù)各離子參數(shù)估計(jì)的結(jié)果，結(jié)合陰陽(yáng)離子電荷平衡，形成了人工模擬鹽堿地鹽分配方，并將其成功應(yīng)用于室內(nèi)小麥芽期鹽堿耐性的鑒定與評(píng)價(jià)中，鹽堿耐性鑒定結(jié)果與小麥田間實(shí)際表現(xiàn)吻合。