葉曉莉，高 越，宋 清，陳 玲，吳梅君，王叢瑤，王彬輝

(1浙江省臨床腫瘤藥理與毒理學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院·浙江 杭州 310006；2浙江省立同德醫(yī)院·浙江 杭州 310053；3臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬市立醫(yī)院·浙江 臺(tái)州 318000；4杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院·浙江 杭州 311200)

大黃素(Emodin, Emo)為中藥大黃中提取的一種蒽醌類衍生物，具有抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用，能有效治療結(jié)腸腫瘤[1-5]。然而大黃素半衰期短，難溶于水，很難通過(guò)血液運(yùn)輸被機(jī)體腫瘤組織吸收，導(dǎo)致口服生物利用度低，制約了大黃素制劑開發(fā)與臨床應(yīng)用[6-7]。

微丸又稱小丸(pellets)，是指直徑約為0.5～1.5 mm的小球狀口服固體制劑。屬于一種多單元?jiǎng)┝糠稚⑿椭苿ǔＲ粋€(gè)劑量由幾十至幾百個(gè)微丸組成，個(gè)別微丸制備上的缺陷不會(huì)對(duì)微丸整體造成影響。食物輸送節(jié)律不會(huì)影響其轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，具有吸收均勻、生物利用度高等特點(diǎn)[8-9]。研究表明藥物通過(guò)結(jié)腸的時(shí)間與其體積成反比，因此，微丸是近年來(lái)制備口服結(jié)腸定位給藥系統(tǒng)(oral colon specific drug delivery systems, OCDDS)較為理想的劑型。本實(shí)驗(yàn)以大黃素為模型藥物，采用離心造粒包衣機(jī)以粉末層積法設(shè)計(jì)了時(shí)滯型與pH依賴相結(jié)合的結(jié)腸定位給藥微丸；SD大鼠尾靜脈給藥，采用HPLC法研究載藥微丸在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)，為大黃素結(jié)腸腫瘤靶向新型給藥系統(tǒng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；LLB-400型離心流動(dòng)型包衣造粒機(jī)：成都永泰制藥化工機(jī)械廠；PHS-3C型精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司。

1.2 藥品和試劑 大黃素(純度>95%)：成都農(nóng)興生物科技有限公司，批號(hào)：LX-090320-5；大黃素對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110756-2004110；肝素鈉：常州千紅生化制藥股份有限公司，批號(hào)：120308；甲醇和乙腈均為色譜純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康成年SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(280±10)g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SYXK(浙)2013-0184。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合本校動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南。

2 方法

2.1 pH依賴-時(shí)控型大黃素微丸的制備

2.1.1 時(shí)滯微丸包衣 時(shí)滯層包衣液最佳處方：時(shí)滯層材料Eudragit RL 30D增重5%，致孔劑HPMC用量60%，抗黏劑滑石粉用量50%，增塑劑檸檬酸三乙酯用量15%。取500 g載藥微丸，置離心造粒包衣機(jī)內(nèi)，開啟設(shè)備。儀器開啟參數(shù)為：主機(jī)轉(zhuǎn)速100 r/min，噴氣壓力0.3 MPa，漿泵轉(zhuǎn)速9.0 r/min，包衣溫度35 ℃。包衣過(guò)程中持續(xù)攪拌包衣液，包衣結(jié)束后，40 ℃塑化12 h，篩分出18～24目微丸。

2.1.2 pH依賴微丸包衣 pH依賴層包衣液最佳處方：pH依賴層材料Eudragit FS 30D增重4.6%，抗黏劑滑石粉用量50%，增塑劑檸檬酸三乙酯用量5%。稱取適量時(shí)滯層微丸，置離心造粒包衣機(jī)內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行外層包衣，按“2.1.1”項(xiàng)下時(shí)滯微丸包衣的工藝參數(shù)開啟儀器。待包衣液噴完后，加入微粉硅膠2.0 g，40 ℃塑化6 h，即得pH依賴-時(shí)滯型大黃素結(jié)腸定位微丸。

2.2 藥動(dòng)學(xué)

2.2.1 大黃素對(duì)照品溶液的配制 精密稱取Emo對(duì)照品適量，用甲醇溶解定容置100 mL容量瓶中，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 血漿處理 大鼠血漿300 μL以1∶1加入等量30 % H2SO4，旋渦振蕩30 s，(70±2)℃水浴鍋中水解30 min。待冷卻加600 μL乙醚，旋渦3 min離心(10 000 r·min-1，5 min)，傾出乙醚層后在剩余水相中加入乙醚600 μL同法再萃取1次，合并乙醚液N2吹干，殘?jiān)蛹状?00 μL溶解。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1磷酸溶液(75∶25)；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量20 μL。

2.2.4 專屬性考察 取空白血漿、空白血漿+大黃素對(duì)照品溶液、口服pH依賴-時(shí)控型大黃素微丸血漿，考察其專屬性，結(jié)果見圖1。色譜峰專一、靈敏，且峰形良好，內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾。大黃素的保留時(shí)間約為13.89 min。

圖1 高效液相色譜圖(1.大黃素)

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 空白血漿中加入大黃素對(duì)照品溶液，得系列濃度：0.514、2.056、5.14、10.28、20.56、30.84、51.4 mg·L-1，用HPLC測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=22.173+30.173 C(n=7)(r=0.9994)。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 為保證在選用的色譜條件下大黃素定量分析的準(zhǔn)確性，分別考察大黃素的保留時(shí)間及峰面積的重復(fù)性。分別選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍的中間濃度點(diǎn)連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果大黃素的保留時(shí)間、峰面積的RSD分別為0.18%和0.82%。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 制備質(zhì)量濃度分別為51.4、20.56、0.514 mg·L-1的大黃素血漿對(duì)照品溶液，同一天內(nèi)測(cè)5次，連續(xù)5 d各測(cè)1次，計(jì)算日內(nèi)及日間精密度，日內(nèi)及日間精密度RSD分別少于1.25%和1.91%，符合要求。

2.2.8 方法回收率試驗(yàn) 制備質(zhì)量濃度分別為0.514、20.56、51.4 mg·mL-1的大黃素血漿對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行進(jìn)3針，測(cè)定方法回收率。方法回收率分別為92.99±1.92(RSD=2.06)、94.36±3.68(RSD=3.90)、95.97±2.46(RSD=2.56)，符合要求。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 制備質(zhì)量濃度分別為51.4、20.56、0.514 mg·L-1的大黃素血漿對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行進(jìn)3針，常溫穩(wěn)定性RSD少于2.0%，符合要求。

2.2.10 給藥及采樣 實(shí)驗(yàn)共分兩組，大黃素溶液組和pH依賴-時(shí)滯型大黃素微丸組，每組各6只SD大鼠，分別口服給藥200.0 mg·kg-1(以大黃素量計(jì)算)，并通過(guò)股動(dòng)脈插管取血，血漿置于肝素化的離心管中，離心10 min (13 000 r·min-1)，分離血漿，-70 ℃保存。

對(duì)照組：給予大黃素原料藥，稱取大黃素原藥適量，配制成混懸液，大鼠灌胃給予大黃素混懸液適量，分別于給藥后0.083、0.167、0.25、0.5、l、2、3、4、5、6、8、12、16 h取血0.5 mL。實(shí)驗(yàn)組：給予pH依賴-時(shí)滯型大黃素結(jié)腸定位微丸，經(jīng)口插入聚乙烯管(直徑4 mm)，通過(guò)聚乙烯管給大鼠口服微丸適量，分別于給藥后l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16 h取血0.5 mL。

3 結(jié)果

3.1 pH依賴-時(shí)滯型大黃素微丸的理化性質(zhì) pH依賴-時(shí)滯型大黃素結(jié)腸定位微丸圓整度好，粒徑分布均勻，且包衣膜厚度均一，不易發(fā)生微丸間藥物釋放的顯著差異。

3.2 pH依賴-時(shí)滯型大黃素微丸的藥動(dòng)學(xué) 以時(shí)間為橫坐標(biāo)，血藥濃度為縱坐標(biāo)，繪制大黃素溶液和pH依賴-時(shí)滯型大黃素微丸藥-時(shí)曲線。見圖2。采用DAS2.0 藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)矩分析處理，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，見表1。并采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。

圖2 大黃素溶液和pH依賴-時(shí)滯型大黃素微丸藥-時(shí)曲線(動(dòng)物數(shù)：6)

由圖1和表1可知，大鼠口服pH依賴-時(shí)滯型大黃素微丸后，藥物在體內(nèi)的半衰期(T1/2)、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)和滯留時(shí)間(MRT)均延長(zhǎng)，說(shuō)明結(jié)腸靶向微丸進(jìn)入大鼠體內(nèi)釋放相對(duì)緩慢，具有一定的緩釋作用，延長(zhǎng)了體內(nèi)作用時(shí)間，pH依賴-時(shí)滯型微丸延長(zhǎng)了其體內(nèi)滯留時(shí)間，改變了其藥動(dòng)學(xué)行為。

表1 大黃素溶液和pH依賴-時(shí)滯型大黃素微丸藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

4 討論

口服結(jié)腸定位給藥系統(tǒng)(OCDDS)作為一種新型給藥系統(tǒng)具有廣闊的應(yīng)用前景，通過(guò)增加藥物在結(jié)腸部位的局部濃度，避免藥物在胃及小腸的吸收，可有效治療結(jié)腸癌、過(guò)敏性腸道綜合征和炎癥性腸道疾病，使藥物富集于病變部位發(fā)揮作用，提高治療效果，減少不良反應(yīng)[10-11]。本文采用離心造粒包衣技術(shù)，首先制備了MCC空白丸芯，然后在空白丸芯表面層積藥物層(大黃素)，得到大黃素素丸；最后對(duì)大黃素素丸進(jìn)行兩層包衣：內(nèi)層采用Eudragit RL 30D水分散體作為時(shí)滯層材料對(duì)大黃素素丸進(jìn)行包衣，制備時(shí)滯微丸；再外層采用Eudragit FS 30D水分散體作為pH依賴層材料對(duì)時(shí)滯微丸進(jìn)行包衣，即得pH依賴-時(shí)滯型大黃素結(jié)腸定位微丸。大鼠灌胃給予微丸后，對(duì)其進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)研究，探討pH依賴-時(shí)滯型大黃素結(jié)腸定位微丸在大鼠體內(nèi)的釋藥特性。

采用大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究結(jié)腸定位微丸體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)時(shí)，給藥方法是一大難題。灌胃針僅僅適合于溶液、混懸液的給藥，并不適合給予本課題的微丸。因?yàn)橹苽涞奈⑼杈哂休^大的粒徑，而常規(guī)的灌胃針針頭直徑較微丸的直徑小，為了保證微丸在不被破壞的前提下能完整的到達(dá)動(dòng)物體內(nèi)，故在灌胃給予pH依賴-時(shí)滯型大黃素結(jié)腸定位微丸時(shí)，采用在大鼠口中插入適宜大小的聚乙烯管(直徑4 mm)，依靠聚乙烯管的柔韌性及微丸良好的流動(dòng)性，保證了灌胃至大鼠體內(nèi)的微丸是完整的，確保了藥動(dòng)學(xué)研究的準(zhǔn)確性。

從圖2可知：大鼠灌胃給予pH依賴-時(shí)滯型結(jié)腸定位微丸和大黃素溶液后，實(shí)驗(yàn)組在給藥4 h后才檢測(cè)到大黃素，達(dá)峰時(shí)間在7 h，峰濃度為(3.84±0.12) mg·L-1，給微丸后6～12 h的血藥濃度保持在2～4 mg·L-1。對(duì)照組給藥后，藥物吸收較快，1 h即達(dá)到最高峰，峰濃度為(12.81±0.47)mg·L-1，隨后快速消除，6 h時(shí)血液中的藥物濃度低于2 mg·L-1。可以判斷，制備得到的微丸具有結(jié)腸定位的特征，并且血藥濃度較為平穩(wěn)，可以持續(xù)釋放6 h以上，有利于結(jié)腸部位疾病的治療。

從藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可知：實(shí)驗(yàn)組平均滯留時(shí)間(MRT)為(16.42±3.19) h，而對(duì)照組平均滯留時(shí)間(MRT)為(2.71±0.20) h，實(shí)驗(yàn)組的MRT為對(duì)照組6倍；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組AUC0-∞無(wú)明顯差別。實(shí)驗(yàn)組的Tmax較對(duì)照組延長(zhǎng)6 h；表明制備的pH依賴-時(shí)滯型大黃素微丸提高了大黃素在體內(nèi)的吸收程度，延長(zhǎng)了藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間，起到緩釋作用。微丸經(jīng)口服依次通過(guò)胃、小腸到達(dá)結(jié)腸部位的平均時(shí)間約為5～6 h[12]；因此，制備得到的微丸在時(shí)滯時(shí)間上與理論達(dá)到結(jié)腸部位的時(shí)間較為符合。結(jié)合以上參數(shù)，也可以判斷制備得到的pH依賴-時(shí)滯型大黃素結(jié)腸定位微丸具有結(jié)腸定位釋藥特性。