穆佳倩，滕小艷，魏麗榮，仇 榮，桂鵬程，杜玉珍

1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院檢驗科，上海 201306

肺癌患者的5年生存率為14% ～ 17%［1］，轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的主要原因［2］。肺腺癌是肺癌最常見的病理學(xué)類型，骨骼是肺腺癌常見的轉(zhuǎn)移部位［3］，且以溶骨性骨轉(zhuǎn)移多見［4］。肺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后，易伴有骨痛、神經(jīng)壓迫和高鈣血癥等骨相關(guān)事件，嚴重影響患者生存質(zhì)量［5］。

整合素（integrin，ITG）是主要的細胞黏附分子受體，幾乎參與腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的全過程［6］。整合素β3（integrin β3，ITGB3）是整合素家族的重要成員，參與腫瘤的黏附、血管生成［7-9］以及腫瘤親器官性轉(zhuǎn)移等過程［10-11］。然而，ITGB3是否與肺腺癌的骨轉(zhuǎn)移相關(guān)，未見報道。本研究擬通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫和臨床樣本分析ITGB3與肺腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性；并構(gòu)建肺腺癌細胞ITGB3過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，探究ITGB3對肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響及其在肺腺癌骨轉(zhuǎn)移中可能的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞系及主要試劑

人肺腺癌細胞系A(chǔ)549、PC9，大細胞肺癌細胞系NCI-H460，小細胞肺癌細胞系SBC3、SBC5和正常的人胚肺細胞系MRC5均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；高糖DMEM、RPMI-1640、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素（雙抗）、G418、不含EDTA胰酶、Exo-free FBS均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；FITC 抗人CD61抗體、Human Integrin beta-3（ITGB3）ELISA試劑盒購自美國Elabscience公司；化學(xué)發(fā)光試劑ECL購自美國Millipore公司；細胞周期與凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司；兔抗人Integrin β3單克隆抗體、兔抗人MMP2單克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；鼠抗人MMP9單克隆抗體、鼠抗人CD63單克隆抗體均購自美國Arigo公司；兔抗人TSG101單克隆抗體購自英國Abcam公司；exoRNeasy Serum/Plasma Midi試劑盒購自美國QIAGEN公司；人外周血淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）均購自美國R&D systems公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒購自北京博樂通生物科技有限公司。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov/）中下載經(jīng)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的肺癌數(shù)據(jù)集，分析ENSG00000259207（ITGB3）基因在肺癌中的表達及與肺腺癌分期的相關(guān)性，對每個表達值進行l(wèi)og2（x+0.001）變換；采用R 3.6.4軟件并使用秩和檢驗（Wilcoxon Rank Sum Tests）和符號秩檢驗（Wilcoxon Signed Rank Tests）進行差異顯著性分析。

1.3 患者血漿樣本的收集與外泌體ITGB3的檢測

收集2020年4月—2021年9月在上海市第六人民醫(yī)院就診的肺腺癌患者血漿，共49例。其中，肺腺癌無轉(zhuǎn)移患者15例、肺腺癌骨轉(zhuǎn)移患者10例、肺腺癌其他轉(zhuǎn)移患者9例，同時，收集15名健康體檢者血漿作為對照組。血漿的收集均使用含EDTA抗凝劑的紫色真空采集管，并在采血后1 h于4 ℃條件下、3000×g離心10 min，收集上層血漿，于 4 ℃、11000×g離心10 min。本項目經(jīng)上海市第六人民醫(yī)院臨床倫理委員會批準(zhǔn)。

按照exoRNeasy Serum/Plasma Midi 試劑盒說明書要求提取患者血漿中的外泌體，采用透射電鏡檢測外泌體形態(tài)，采用粒徑分析（NTA）檢測外泌體大小，采用Western blot檢測外泌體標(biāo)志物TSG101和CD63的表達水平，采用Western blot和ELISA檢測血漿外泌體ITGB3蛋白水平。

1.4 細胞培養(yǎng)及細胞株的篩選

采用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549、SBC3和SBC5細胞系，采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)NCI-H460和PC9細胞系，MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MRC5細胞系，培養(yǎng)基中均加入10%的胎牛血清和1%的青霉素和鏈霉素，細胞在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，采用Western blot檢測各細胞ITGB3蛋白的表達水平，選取ITGB3低表達的肺癌細胞進行后續(xù)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建。

1.5 質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)株的鑒定

在GenBank數(shù)據(jù)庫中查閱人源ITGB3全長的編碼區(qū)序列（ENST00000559488.5），采用PCR對靶序列進行擴增。將ITGB3目的片段與 pcDNA-3.1+/Neo質(zhì)粒進行重組并酶切鑒定。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染實驗分為對照組（即空白細胞A549、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的A549-Mock＋）和實驗組（轉(zhuǎn)染ITGB3過表達質(zhì)粒的A549-ITGB3＋）。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染嚴格按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，并使用G418（750 μg/mL）篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。

穩(wěn)轉(zhuǎn)株的鑒定：取對數(shù)生長期細胞，用不含EDTA胰酶消化并離心，冷的PBS洗，加入FITC標(biāo)記的ITGB3抗體（用含3% BSA和0.1%Triton的PBS稀釋）4 ℃避光溫育 30 min，冷的PBS洗，采用流式細胞術(shù)檢測ITGB3蛋白的表達水平；并用Western blot檢測ITGB3蛋白的表達水平。

1.6 細胞外泌體的分離鑒定

采用差速離心法，即細胞在含10% Exo-free FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，4 ℃條件下200×g離心10 min，上層液體2 000×g離心15 min，上層液體10 000×g離心30 min。繼續(xù)收集上清液轉(zhuǎn)移至外泌體超濾離心管中 （100 KD），3 000×g離心30 min，濃縮液經(jīng)0.22 μm孔徑濾器過濾，100 000×g離心70 min，沉淀物加PBS溶解分裝于-20 ℃保存用于后續(xù)分析。鑒定同血漿外泌體。

1.7 細胞周期

按照細胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書要求對不同實驗分組細胞進行染色，采用流式細胞術(shù)對細胞周期進行分析。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Modfit軟件進行分析。

1.8 克隆形成

不同實驗分組細胞計數(shù)600個，分別接種于6孔板，培養(yǎng)2 ～ 3周，棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定細胞、結(jié)晶紫染色、風(fēng)干。倒置顯微鏡下觀察克隆集落并拍照；使用Image J軟件對各組細胞的克隆集落進行計數(shù)。

1.9 Transwell小室實驗

Matrigel基質(zhì)膠按1∶8比例稀釋，取100 μL鋪入transwell上室，細胞計數(shù)1×105個接種至上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定細胞，結(jié)晶紫染色，棉簽擦去小室上層未侵襲的細胞，空氣中干燥。顯微鏡下隨機選取3個視野觀察并拍照，使用Image J軟件對侵襲的細胞進行計數(shù)，以反映細胞侵襲能力。細胞遷移能力的檢測：transwell上室內(nèi)不鋪基質(zhì)膠，24 h終止實驗，其余操作同侵襲實驗。

1.10 Western blot檢測

收集細胞加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量，每組取30 μg總蛋白于10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）中分離，恒壓100 V轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂牛奶封閉，其中一抗均按1∶1 000的比例稀釋（ITGB3、MMP9、MMP2、TSG101、CD63和GAPDH），HRP標(biāo)記的二抗按1∶5 000比例稀釋，溫育PVDF膜，一抗4 ℃過夜，二抗室溫溫育1 h，TBST洗滌。使用化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯影，使用Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.11 外泌體ITGB3誘導(dǎo)破骨細胞分化實驗

取人的外周血10 mL按1∶1比例加PBS混勻，按照淋巴細胞分離液說明書提取人外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），細胞計數(shù)鋪96孔板，2×105每孔。培養(yǎng)液中加30 ng/mL RANKL、15 ng/mL M-CSF，隔天換液，誘導(dǎo)7 d后加入肺腺癌細胞分泌ITGB3表達水平不同的外泌體（70 μg/mL）共培養(yǎng)。培養(yǎng)至14 d，按照TRAP染色說明書對細胞染色，顯微鏡下觀察多核破骨細胞分化情況。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理，實驗數(shù)據(jù)采用x±s表示。兩組間的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ITGB3表達水平與肺癌臨床特征的相關(guān)性

分析TCGA數(shù)據(jù)庫下載的肺癌數(shù)據(jù)集可知，ITGB3在肺腺癌組織中的表達顯著高于正常組織和肺鱗癌組織（P＜0.000 1，圖1A），在Ⅳ期肺腺癌組織中顯著升高（P＜0.000 1，圖1B）。以上結(jié)果表明，ITGB3高表達與肺腺癌進展相關(guān)。

提取患者血漿外泌體，使用透射電鏡（圖1C）、NTA分析（圖1D）和Western blot（圖1E）對外泌體進行形態(tài)大小分析和鑒定。對肺腺癌患者血漿外泌體中ITGB3的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)肺腺癌骨轉(zhuǎn)移患者血漿外泌體ITGB3水平高于其他轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.000 1，圖1E、F），提示外泌體ITGB3與肺腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)。

圖1 ITGB3的表達水平與肺癌臨床特征的相關(guān)性Fig.1 The correlation between the expression level of ITGB3 and the clinical features of lung cancer

2.2 ITGB3對肺腺癌細胞生物學(xué)行為的影響

2.2.1 ITGB3過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建

檢測不同肺癌細胞株中ITGB3表達水平（圖2A），選取ITGB3表達相對較低的A549細胞構(gòu)建ITGB3過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞A549-ITGB3＋；驗證發(fā)現(xiàn)A549-ITGB3＋細胞中ITGB3的表達水平顯著高于對照組（1.033±0.114vs0.131±0.034，P＜0.05）（圖2B、C）。分離A549和A549-ITGB3+細胞分泌的外泌體，外泌體的鑒定同血漿外泌體（圖2D ～ F）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A549-ITGB3+細胞分泌的外泌體中ITGB3高表達（圖2F）。

圖2 A549 ITGB3過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的的構(gòu)建Fig.2 Construction of A549 ITGB3 overexpression stable cell line

2.2.2 ITGB3對肺腺癌A549細胞周期、克隆形成的影響

流式細胞術(shù)細胞周期實驗結(jié)果顯示，A549-ITGB3＋細胞周期與對照細胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.556，圖3A）；克隆形成實驗顯示，A549-ITGB3＋細胞的克隆集落形成率與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.930，圖3B），提示ITGB3過表達對A549細胞周期和克隆形成無明顯影響。

圖3 ITGB3過表達對A549細胞周期和克隆形成的影響Fig.3 The effect of ITGB3 overexpression on A549 cell cycle and clone formation

2.2.3 ITGB3對肺腺癌A549細胞侵襲和遷移的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A549-ITGB3＋細胞的穿膜數(shù)目顯著高于對照組（侵襲：1366±96.50vs623.3±41.36，遷移：1201±107.2vs500±34.51，P＜0.001，圖4A、B）。檢測侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP9、MMP2蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)A549-ITGB3＋細胞的中MMP9和MMP2水平顯著高于對照組（圖4C），提示ITGB3可能通過上調(diào)MMP2、MMP9表達來促進細胞的侵襲和遷移。

圖4 ITGB3過表達對A549細胞侵襲和遷移能力的影響Fig.4 The effect of ITGB3 overexpression on the invasion and migration ability of A549 cells

2.3 細胞外泌體ITGB3對破骨細胞分化的促進作用

為進一步探討細胞外泌體ITGB3對破骨細胞分化的影響，將外泌體用于破骨細胞的誘導(dǎo)分化，采用TRAP染色觀察各組破骨細胞（TRAP染色陽性且核＞3個的細胞）的分化情況。結(jié)果顯示，A549-ITGB3+細胞外泌體誘導(dǎo)的破骨細胞分化效率顯著高于對照組（11.50±0.707vs5.5±0.707，P＜0.05，圖5），提示肺腺癌細胞高表達ITGB3的外泌體可促進破骨細胞的分化。

圖5 TRAP染色顯示肺腺癌細胞分泌的外泌體對破骨細胞分化的影響Fig.5 TRAP staining shows the effect of exosomes secreted by lung adenocarcinoma cells on the differentiation of osteoclasts.

3 討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后差的重要因素，肺腺癌引起的溶骨性骨轉(zhuǎn)移嚴重影響患者生存質(zhì)量和生存期［12］。在臨床上，肺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷主要依靠影像學(xué)和骨穿刺活檢等，因靈敏度、特異度低以及輻射性等局限性，難以實現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移的早發(fā)現(xiàn)、早診斷［13］。目前，肺腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機制尚不清楚，因此，在臨床實踐中，缺乏可用于監(jiān)測骨轉(zhuǎn)移的有效分子標(biāo)志物。

ITGB3是整合素家族的重要成員，其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用已有較多的報道［14］。有研究報道，骨轉(zhuǎn)移腫瘤細胞高表達αvβ3，并可通過與骨基質(zhì)細胞因子骨橋蛋白、骨涎蛋白和纖連蛋白結(jié)合，從而促進腫瘤細胞與骨基質(zhì)微環(huán)境的黏附［15］。將過表達ITGB3的小鼠乳腺癌細胞66cl4注射到同基因小鼠脛骨中可導(dǎo)致破骨細胞募集和骨吸收增加［16］。還有報道，認為ITGB3在腫瘤的親骨性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，如在小鼠靜脈注射轉(zhuǎn)移模型中，將B16黑色素瘤細胞分別注入ITGB3靶向缺失及野生型小鼠的左心室，發(fā)現(xiàn)ITGB3靶向缺失的小鼠僅有4%發(fā)生溶骨性骨轉(zhuǎn)移和骨破壞，而有74%的野生型小鼠在14 d內(nèi)發(fā)生溶骨性骨轉(zhuǎn)移和骨破壞［17］。這些研究結(jié)果提示，ITGB3與腫瘤骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生可能存在密切關(guān)系。

本研究首先通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)ITGB3與肺腺癌的進展相關(guān)，收集肺腺癌患者血漿血漿外泌體，檢測ITGB3水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外泌體ITGB3水平不僅與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而且與腫瘤患者的骨轉(zhuǎn)移呈高度正相關(guān)。進而，采用肺腺癌A549細胞系構(gòu)建ITGB3過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株（A549-ITGB3+），收集A549、A549-ITGB3+細胞分泌的外泌體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ITGB3過表達的A549-ITGB3+細胞的外泌體ITGB3也過表達。隨后，將腫瘤細胞分泌的ITGB3表達水平不同的外泌體用于破骨細胞誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)ITGB3高表達的外泌體對破骨細胞的促分化作用更明顯。以上結(jié)果提示，ITGB3與腫瘤骨轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能是診斷肺腺癌骨轉(zhuǎn)移的潛在分子標(biāo)志物。

本研究就ITGB3對肺腺癌骨轉(zhuǎn)移的促進作用進行了初步探討，同時，根據(jù)生物信息分析和患者血漿外泌體ITGB3的小樣本定量檢測，提示外泌體ITGB3可能是肺腺癌骨轉(zhuǎn)移的潛在分子標(biāo)志物，但以上推測只有體外干預(yù)實驗的證據(jù)和小樣本患者數(shù)據(jù)的支持，仍需要進一步體內(nèi)干預(yù)實驗的證據(jù)以及大樣本臨床數(shù)據(jù)進行驗證。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。