肖瀟，王鵬，邵童，馬昕怡，顧瑞霞，陳霞

(江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(揚(yáng)州大學(xué))，江蘇 揚(yáng)州，225000)

發(fā)酵乳是牛乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制成的具有獨(dú)特風(fēng)味、均衡營(yíng)養(yǎng)以及多重生理功能的乳制品[1]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)健康、營(yíng)養(yǎng)型功能食品需求的不斷增加，功能性發(fā)酵乳開(kāi)發(fā)已成為食品行業(yè)的研究熱點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者開(kāi)展了添加蛋白質(zhì)和多肽的功能發(fā)酵乳研究，如添加蛋清蛋白[2]、乳清蛋白水解物[3]和大豆分離蛋白酶解物[4]等可以提高發(fā)酵乳的貯藏穩(wěn)定性和益生菌活性；同時(shí)也有人研究將核桃粕多肽[5]、膠原蛋白肽[6]、小麥面筋蛋白肽[7]等用于功能性發(fā)酵乳的開(kāi)發(fā)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不僅可以提高發(fā)酵乳的小分子肽含量，還可以提高發(fā)酵乳的抗氧化活性等功能。

火麻是一種重要的食品、醫(yī)藥和纖維植物，在我國(guó)廣西、云南等地種植廣泛[8]?；鹇槿适腔鹇榈某墒旆N仁，富含油脂、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，是優(yōu)質(zhì)的植物油脂和蛋白資源[9]。火麻仁粕是火麻仁提取完油脂后的副產(chǎn)物，約含33%的蛋白質(zhì)，不含蛋白酶抑制劑，且必需氨基酸和精氨酸含量較高，屬高價(jià)值植物蛋白資源。但目前大多數(shù)火麻仁粕都被用于飼料或肥料，造成極大的資源浪費(fèi)[10]。本試驗(yàn)從火麻仁粕中提取蛋白質(zhì)，并利用堿性蛋白酶酶解不同時(shí)間后，得到不同水解度的火麻仁粕蛋白水解液(hemp seed meal protein hydrolysate, HP)。然后將HP添加到發(fā)酵乳中，研究不同酶解度的HP對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)及抗氧化活性的影響，以期為開(kāi)發(fā)新的功能發(fā)酵乳和提高資源利用率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

乳粉，揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司；脫脂火麻仁粕，遼寧俏牌生物科技有限公司；白砂糖，揚(yáng)州麥德龍超市采購(gòu)；嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌，江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保藏；堿性蛋白酶，浙江一諾生物科技有限公司；水楊酸、鐵氰化鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵，天津科密歐試劑有限公司；DPPH，麥克林；三氯乙酸，上海山浦化工有限公司；NaOH、HCl、濃H2SO4及其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1510型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；JF-SX-500全自動(dòng)滅菌鍋，日本TOMY公司；5804R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)EPPEENDORF公司；SPX-150BS生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；pH S-25 型數(shù)顯pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó)FTC公司；全自動(dòng)凱氏定氮儀，北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司；FREEZONE18L冷凍干燥機(jī)，美國(guó)LABCONCO公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 火麻仁粕蛋白的提取

參考林金鶯[11]的方法提取火麻仁粕中的蛋白質(zhì)，并將其冷凍干燥。

1.3.2 火麻仁粕蛋白水解

火麻仁粕蛋白與去離子水以質(zhì)量比1∶25配制蛋白溶液，每克蛋白質(zhì)加入2 000 U堿性蛋白酶，酶解溫度45 ℃，酶解pH 8.5，分別水解4、8、12、16、20 h，沸水滅酶10 min，冷卻，將溶液調(diào)至中性，離心收集上清液，得HP，分別記為H-4、H-8、H-12、H-16、H-20。

1.3.3 火麻仁粕蛋白水解度測(cè)定

參考陳霞等[12]的方法測(cè)定火麻仁粕蛋白水解度。

1.3.4 發(fā)酵乳樣品制備工藝流程

發(fā)酵乳樣品制備工藝流程如下：

12%全脂復(fù)原乳+7%白砂糖+6%HP→混合→均質(zhì)(55 ℃，20 MPa)→滅菌(95 ℃，10 min)→冷卻(42 ℃左右)→接種(3%)→發(fā)酵(42 ℃)→后熟(4 ℃，24 h)→成品

1.3.5 凝乳時(shí)間確定

參考胡凱麗等[13]的方法，待發(fā)酵乳滴定酸度至75 °T時(shí)記為發(fā)酵完成，記錄時(shí)間。

1.3.6 質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定

參考陳霞等[12]的方法，采用質(zhì)地剖面分析(texture profile analysis,TPA)法，使用TMS-PRO 質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)的測(cè)定。測(cè)試條件：力量感應(yīng)元的量程25 N；起始力0.01 N，檢測(cè)速度1 cm/min，形變百分量60%。

1.3.7 pH值和滴定酸度測(cè)定

發(fā)酵乳的pH值參考GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》使用精密pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定；發(fā)酵乳的滴定酸度參考GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 持水率測(cè)定

參考陳霞等[12]的方法，稱取7.00 g的發(fā)酵乳置于10 mL離心管中，6 000 r/min，30 min條件下離心，稱量上清液質(zhì)量。發(fā)酵乳的持水率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.9 活菌數(shù)測(cè)定

參考GB 4789.35—2016中的平板計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵乳中的活菌數(shù)。

1.3.10 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照GB 19302—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》進(jìn)行設(shè)定，參評(píng)人員為接受過(guò)感官評(píng)定培訓(xùn)的食品科學(xué)專業(yè)的10位學(xué)生(5男5女)，按照表1對(duì)發(fā)酵乳進(jìn)行感官評(píng)分。

表1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criterion of sensory evaluation

1.3.11 抗氧化能力測(cè)定

1.3.11.1 樣品前處理

于10 mL離心管中加入3 g發(fā)酵乳樣品和4 mL甲醇，超聲1 h，8 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液。

1.3.11.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考LEE等[14]的方法，于517 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.11.3 羥自由基清除能力測(cè)定

參考SHEN等[15]的方法，于510 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.11.4 總還原能力測(cè)定

參考WANG 等[16]的方法，于700 nm測(cè)定吸光度。吸光值越高，還原能力越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0和Origin 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 火麻仁粕蛋白酶解液的水解度分析

火麻仁粕蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解不同時(shí)間的水解度如表2所示?；鹇槿势傻鞍酌附庖旱牡鞍踪|(zhì)含量、氨態(tài)氮含量和水解度均隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷升高，且在前12 h內(nèi)水解度顯著升高(P< 0.05)，12 h后水解度上升緩慢。說(shuō)明在前12 h內(nèi)絕大多數(shù)的火麻仁粕蛋白被酶解成短肽鏈，之后由于底物濃度和酶濃度的降低，且受酶解產(chǎn)物的抑制，酶解速率降低。為研究不同水解度HP對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)的影響，選取低(H-4)、中(H-8)、高(H-12)3 個(gè)不同水解度的HP添加到發(fā)酵乳中，研究發(fā)酵乳品質(zhì)及抗氧化活性的變化。

表2 火麻仁粕蛋白酶解液的水解度變化Table 2 Changes in the hydrolyzing degree of hemp seed meal protein hydrolysate

2.2 不同水解度HP對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

由表3可知，添加HP能顯著降低發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間和膠黏性，提高發(fā)酵乳的內(nèi)聚性、彈性和感官評(píng)分。空白組的凝乳時(shí)間為8.04 h，H-4、H-8和H-12組的凝乳時(shí)間分別比空白組縮短了1.44、1.80和1.99 h，說(shuō)明水解度高的HP促發(fā)酵效果較好。原料奶里非蛋白氮含量較低，添加HP增加了發(fā)酵乳中小分子肽類和游離氨基酸的含量和種類，增加了乳酸菌可利用的氮源物質(zhì)，可以促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)代謝，使凝乳時(shí)間顯著縮短。發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性與酪蛋白的凝膠特性有直接的關(guān)系，HP含有的小分子肽可以增大發(fā)酵乳的黏度，同時(shí)可以促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)產(chǎn)生胞外多糖，從而使發(fā)酵乳的內(nèi)聚性和彈性增大[17]。趙強(qiáng)忠等[18]研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白經(jīng)胰酶酶解24 h得到的酶解液對(duì)酸乳有較強(qiáng)的促發(fā)酵作用和增黏作用。添加了HP的3組發(fā)酵乳樣品兼具發(fā)酵乳的香味和HP的香氣，口感細(xì)膩，質(zhì)地均勻，感官評(píng)分均顯著高于空白組(P<0.05)，其中H-8組感官評(píng)分最高，為88.0分，產(chǎn)品的發(fā)酵乳香氣和肽液的香氣協(xié)調(diào)，口感最佳。

表3 發(fā)酵乳的發(fā)酵性能表Table 3 Fermentation performance table of fermented milk

2.3 HP水解度對(duì)發(fā)酵乳貯藏特性的影響

2.3.1 發(fā)酵乳貯藏過(guò)程中滴定酸度的變化

由圖1可知，隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，4組發(fā)酵乳的滴定酸度均不斷升高，其中空白組升高的幅度最大，到第21天時(shí)達(dá)到92.0 °T，比第0天高了17.0 °T；而添加量HP的3組樣品的滴定酸度增幅均明顯低于對(duì)照組，其中H-8組在冷藏至21 d時(shí)的滴定酸度最低，為87.5 °T。這是因?yàn)樵诘蜏刭A藏過(guò)程中，乳酸菌仍會(huì)利用發(fā)酵乳中的乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸，造成發(fā)酵乳酸度的持續(xù)上升，酸度過(guò)高則會(huì)影響產(chǎn)品的可接受度。HP中的蛋白質(zhì)具有一定的酸中和能力，對(duì)于延長(zhǎng)發(fā)酵乳的保質(zhì)期和儲(chǔ)藏期間的穩(wěn)定性有一定的效果。趙強(qiáng)忠等[4]研究發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物中的小分子組分可通過(guò)降低酸奶中的桿/球菌比值從而減緩酸奶的后酸化過(guò)程。

圖1 發(fā)酵乳在貯藏期間的滴定酸度變化Fig.1 Changes of titration acidity fermented milk during storage

2.3.2 發(fā)酵乳貯藏過(guò)程中持水率的變化

持水率的高低可以反映發(fā)酵乳凝膠網(wǎng)絡(luò)體系的穩(wěn)定性。由圖2可知，H-8組的持水率隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)一直保持上升趨勢(shì)，到第21天時(shí)的持水率為33.87%；其余各組的持水率呈先上升后下降趨勢(shì)；其中H-4和H-8組的持水率在貯藏期內(nèi)一直保持較高狀態(tài)，到第21天時(shí)的持水率均大于30.00%，而空白組和H-12組到此時(shí)已經(jīng)降到25.00%以下，說(shuō)明在貯藏后期發(fā)酵乳的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。這是因?yàn)榘l(fā)酵乳在貯藏初期的凝膠結(jié)構(gòu)緊實(shí)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，酸度不斷降低，會(huì)影響酪蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性，其中空白組和H-12組樣品的酸度較低，使得發(fā)酵乳的持水率下降[19]。

圖2 貯藏期內(nèi)發(fā)酵乳持水率的變化Fig.2 Changes in the water holding rate of fermented milk during storage

2.3.3 發(fā)酵乳貯藏過(guò)程中活菌數(shù)的變化

在4 ℃貯藏21 d發(fā)酵乳的活菌數(shù)變化見(jiàn)圖3。添加了HP的3組發(fā)酵乳的活菌數(shù)在21 d內(nèi)均顯著高于空白組，H-4和H-8組在21 d內(nèi)活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)，而空白組在第7天后開(kāi)始下降，第21天時(shí)的活菌數(shù)下降為8.92 lgCFU/g；H-12組的活菌數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，在第14天時(shí)活菌數(shù)達(dá)最高值，為9.31 lgCFU/g。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明添加HP可以促進(jìn)乳酸菌的增殖，HP中的小分子肽和非極性游離氨基酸是乳酸菌理想的氮源，具有促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)代謝的作用，而牛乳中的蛋白質(zhì)因分子質(zhì)量較大，需經(jīng)過(guò)保加利亞乳桿菌水解成酪蛋白才能被嗜熱鏈球菌利用，因而空白組在后期活菌數(shù)下降迅速。胡月等[20]將大豆肽加入凝固型酸奶，發(fā)現(xiàn)大豆肽可以顯著提高其貯藏期內(nèi)的活菌數(shù)和氨基酸含量，可能是因?yàn)榇蠖闺谋旧砗泄劝彼?、亮氨酸、甘氨酸等氨基酸有利于保持乳酸菌生長(zhǎng)。

圖3 貯藏期發(fā)酵乳活菌數(shù)的變化Fig.3 Changes in the number of viable cells of fermented milk during storage

2.4 不同水解度的HP對(duì)發(fā)酵乳體外抗氧化活性的影響

由表4可知，添加了HP的3組樣品的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和總還原能力均顯著高于空白組(P<0.05)，其中H-8組和H-12組的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力顯著高于H-4組，而H-4組的還原能力最高，為0.61%。上述結(jié)果說(shuō)明，添加HP可顯著提供發(fā)酵乳的抗氧化能力，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)被蛋白酶水解后分子構(gòu)象發(fā)生變化，一些具有抗氧化能力的氨基酸殘基被暴露出來(lái)，如色氨酸、酪氨酸、組氨酸和苯丙氨酸等，是樣品組抗氧化能力提高的原因[21]。戴梓茹等[22]研究發(fā)現(xiàn)添加牡蠣肽可以顯著提高酸奶的總還原能力和DPPH自由基清除能力。伍亞龍等[23]利用胰蛋白酶將原料乳適度水解后再接入發(fā)酵劑發(fā)酵，制得的發(fā)酵乳抗氧化活性也顯著提高。

表4 發(fā)酵乳的體外抗氧化活性Table 4 In vitro antioxidant activity of fermented milk

3 結(jié)論

從火麻仁粕中提取蛋白質(zhì)，經(jīng)堿性蛋白酶酶解不同時(shí)間后，得到水解度分別為8.45%、13.24%和16.62%的HP。將HP添加到發(fā)酵乳中，發(fā)現(xiàn)不同水解度的HP均顯著縮短了發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間，降低了發(fā)酵乳的膠黏性，提高了發(fā)酵乳的內(nèi)聚性、彈性和感官評(píng)分；對(duì)發(fā)酵乳貯藏特性的研究表明，添加HP能緩解發(fā)酵乳的后酸化，提高發(fā)酵乳的持水率和活菌數(shù)。發(fā)酵乳的抗氧化活性研究表明，添加HP顯著提高了發(fā)酵乳的抗氧化活性，但H-8組和H-12組的抗氧化活性無(wú)顯著差別。H-8組在貯藏末期酸度上升幅度較小，第21天時(shí)持水率最高，感官評(píng)分最高，活菌數(shù)含量和抗氧化活性也較高，為品質(zhì)最佳的一組樣品發(fā)酵乳。