馬電通，常雪苗，李文清，黃二賓，杜嶸宇，楊清，王芳, 2，鄧佳,3*

1(西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明，650224)2(西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明，650224) 3(西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明，650224)

羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)作為眾多拮抗酵母菌中的一種，因其具有繁殖速率快、對(duì)人體無(wú)毒、廣譜性和不對(duì)環(huán)境產(chǎn)生危害等特點(diǎn)[1]。在國(guó)內(nèi)外常被應(yīng)用于果蔬采后病害的防治與貯藏中，如柑橘、蘋(píng)果和草莓等[1-2]。然而，C.laurentii單獨(dú)使用時(shí)，存在其拮抗效力不及化學(xué)殺菌劑、穩(wěn)定性差、生產(chǎn)成本高、對(duì)病原菌具有選擇性等缺點(diǎn)[3]。利用激發(fā)子誘導(dǎo)培養(yǎng)增強(qiáng)拮抗酵母生防效力的方法，近年來(lái)受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。有研究表明利用糖類(lèi)作為保護(hù)劑，能夠增加酵母細(xì)胞內(nèi)ATP、單糖、多糖等的積累，此外，糖保護(hù)劑還使酵母活性氧的積累減少，從而保護(hù)細(xì)胞減弱氧化損傷[4]。LI等[5]以1%海藻糖作為外源物質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)C.laurentii，使其酵母體內(nèi)海藻糖的含量升高，并提高酵母在凍干條件下的生活力，同時(shí)，還顯著增強(qiáng)低溫及可控氣調(diào)條件下C.laurentii對(duì)蘋(píng)果青霉病的生防效力。因此，在培養(yǎng)基中添加糖類(lèi)物質(zhì)，可以提高菌體的抗氧化脅迫和生防能力。

酵母在外源物質(zhì)的誘導(dǎo)下其形態(tài)會(huì)發(fā)生變化并會(huì)對(duì)酵母自身產(chǎn)生特定的影響，比如抗逆性、存活率和酶的活性等，從而影響自身和應(yīng)用于果蔬中相關(guān)指標(biāo)的變化[6]。遲孟山[7]研究發(fā)現(xiàn)，在0.3%瓊脂的YPD固體培養(yǎng)基上酵母Pichiakudriavzevii和Pichiacecembensis表現(xiàn)為生物膜形態(tài)，而在2%瓊脂的YPD固體培養(yǎng)基上酵母表現(xiàn)為單細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)生物膜形態(tài)的酵母比單細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)出更好的抗逆性、存活率和抗氧化性，當(dāng)把生物膜形態(tài)的2種酵母分別接種于梨和蘋(píng)果的傷口時(shí)，均表現(xiàn)出更好的繁殖速度，對(duì)灰霉和青霉病的防治效果更佳。王東升等[8]研究結(jié)果表明，在低葡萄糖濃度下，扣囊復(fù)膜孢酵母大多為單細(xì)胞酵母形態(tài)，少部分酵母為菌絲體形態(tài)，其葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性顯著高于菌絲體形態(tài)，更能提高酵母的生防效力。上述研究表明，添加糖類(lèi)外源物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)酵母形態(tài)發(fā)生變化，并使酵母體內(nèi)抗病物質(zhì)積累、增強(qiáng)酶活性，提高作用于果蔬的生防效力。

羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)是纖維素的羧甲基化衍生物，為一種糖類(lèi)物質(zhì)，性狀為白色或淡黃色纖維狀粉末，無(wú)臭、無(wú)味。在食品中具有廣泛的用途，常作為食品添加劑和果蔬保鮮劑[9]，對(duì)于食品和果蔬貨架期的延長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)作為近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種研究技術(shù)，能夠從RNA水平上分析出不同環(huán)境條件下同種生物基因的差異表達(dá)量，從而找出關(guān)鍵差異表達(dá)基因，更進(jìn)一步探究差異基因(differential genes，DEGs)的調(diào)控機(jī)制及功能作用[10]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)，能提高C.laurentii對(duì)青霉病的生防效力。因此，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，進(jìn)一步探索CMC對(duì)C.laurentii生理特性的影響，揭示其拮抗作用的分子機(jī)制，以期為C.laurentii在果品采后病害防治的分子機(jī)制研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酵母菌

C.laurentii：ATCC18803，廣東微生物研究所。

1.1.2 試劑

CMC，上海騰準(zhǔn)生物科技有限公司；蛋白胨和麥芽浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；酵母粉，賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MIKRO220R冷凍型臺(tái)式高速離心機(jī)，廣東市華粵儀器有限公司；HH·B11-BS-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；TS-2102C恒溫?fù)u床，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；702型超低溫冰箱，賽默飛世爾科技公司；70型離子交換純水器，上海南華醫(yī)療器械；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；DM750徠卡顯微鏡，成貫儀器(上海)有限公司顯微系統(tǒng)；Nikon YS100型電子顯微鏡，廣州頤騰貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

YM液體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5.0、葡萄糖10.0，酵母粉3.0，麥芽浸粉3.0，pH自然；配制完畢后于121 ℃ 的高壓滅菌鍋滅菌21 min。自然冷卻后，備用。

1.2.2 CMC誘導(dǎo)酵母形態(tài)變化率觀(guān)測(cè)

參考楊新等[11]的操作方法，略作修改。將事先準(zhǔn)備好的種子液按照2%的接種量接種于CMC含量為0(對(duì)照組)、0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))(處理組)的YM液體培養(yǎng)基中(每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù))，裝液量為50/100mL；接種完畢后，在28 ℃、120 r/min的搖床上培養(yǎng)，之后分別在12、24、36、48、72、84、96 h于徠卡顯微鏡取樣觀(guān)察酵母形態(tài)變化(每個(gè)樣品記錄6個(gè)視野)，并計(jì)算其酵母誘導(dǎo)形態(tài)變化率(當(dāng)酵母的縱徑和橫徑比等于1時(shí)視為酵母形態(tài)沒(méi)有改變，當(dāng)其縱橫徑比小于或大于1視為酵母形態(tài)發(fā)生變化)，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序菌體的培養(yǎng)與收集

參考1.2.2中CMC誘導(dǎo)酵母形態(tài)變化率的操作方法，略作修改。將事先準(zhǔn)備好的種子液按照2%的接種量接種于CMC含量為0(對(duì)照組：CK-1、CK-2、CK-3)、0.5%(處理組：CMC-1、CMC-2、CMC-3)的YM液體培養(yǎng)基中(每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù))，裝液量為300/500mL；接種完畢后，在28 ℃、120 r/min的搖床上培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，在4 ℃、8 000 r/min、15 min的條件下離心收集菌體，然后立即置于-80 ℃中冰箱保存。

1.3 RNA提取

冷凍保存的酵母樣品委托廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行酵母RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序及過(guò)濾和生物學(xué)信息分析。

1.4 文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序數(shù)據(jù)分析

在轉(zhuǎn)錄組學(xué)中，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05且差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>1(|log2FC|>1)被認(rèn)為是差異表達(dá)基因，對(duì)達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)的DEGS進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。實(shí)驗(yàn)中各數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，采用t檢驗(yàn)方法分析不同處理組間差異，P<0.05表示差異達(dá)顯著水平，另使用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、并使用Origin 2019軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMC誘導(dǎo)C.laurentii形態(tài)變化率觀(guān)測(cè)

由圖1可知，0.5%CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h時(shí)，酵母形態(tài)變化率比CK組高出4.02%，酵母形態(tài)開(kāi)始發(fā)生顯著性的差異變化(P<0.05)，且其顯著差異變化一直持續(xù)到誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h；72 h之后，0.5% CMC和CK處理組之間變化差異不顯著(P<0.05)。0.5% CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h時(shí)，酵母細(xì)胞形態(tài)如圖2所示。CK組細(xì)胞多以正圓形細(xì)胞酵母形式存在(圖2-a)，0.5% CMC處理組正圓細(xì)胞酵母逐漸減少，橢圓形細(xì)胞酵母逐漸增多(圖2-b)。該結(jié)果表明，CMC誘導(dǎo)對(duì)C.laurentii細(xì)胞形態(tài)變化可能存在某種作用關(guān)系。因此，以0.5% CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞發(fā)生顯著形態(tài)變化的C.laurentii，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從分子水平揭示C.laurentii對(duì)CMC培養(yǎng)的誘導(dǎo)響應(yīng)機(jī)制。

圖1 CMC誘導(dǎo)C.laurentii的形態(tài)變化率Fig.1 Rate of morphological change of C.laurentii induced by CMC 注：圖中不同時(shí)間段的不同小寫(xiě)字母表示顯著性差異(P<0.05)

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控報(bào)告

對(duì)CMC誘導(dǎo)(0.5%)和未誘導(dǎo)培養(yǎng)24 hC.laurentii進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果如表1所示，測(cè)序質(zhì)量控制后，共得到36.82 Gb純凈數(shù)據(jù)。CK處理組和CMC處理組堿基堿基Q30平均值分別為6 487 935 247、5 907 988 763條，占比為93.48%和94.80%；堿基Q20平均值分別為6 774 082 121、6 117 749 022條，占比為97.56%和98.16%；同理，GC的堿基平均值分別為4 157 214 861、3 722 095 089條，占比為59.86%和59.72%。以上數(shù)據(jù)，說(shuō)明該轉(zhuǎn)錄組測(cè)序堿基質(zhì)量好，準(zhǔn)確性高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析。

a-未誘導(dǎo)的酵母；b-CMC誘導(dǎo)的酵母圖2 CMC誘導(dǎo)處理24 h的C.laurentii形態(tài)變化(10×40)Fig.2 Morphological changes of C.laurentii induced by CMC treatment for 24 h(10×40)

表1 堿基信息統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table of base information

2.3 基因比對(duì)率統(tǒng)計(jì)

由表2可知，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的純凈序列中，能定位到基因組上的純凈序列平均值為42 588 444條和38 122 146條，占比為91.58%～92.08%，在參考序列上，能比對(duì)上多個(gè)序列的基因的平均值為38 903和34 678條，占比為0.08%～0.09%，在參考序列上，只有唯一比對(duì)位置序列基因的平均值為42 549 542條和38 087 468條，占比為91.49%～92.0%。其中能定位到純凈序列上的基因占比都>91.58%，而在參考序列上有多個(gè)比對(duì)位置的基因序列數(shù)均<1%，因此，本次所測(cè)序列沒(méi)有受到污染，可以開(kāi)展后續(xù)基因序列的組裝和分析。

2.4 組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

從表3和圖3-a可得，N50的數(shù)量遠(yuǎn)低于基因的數(shù)量，而且其長(zhǎng)度高于基因的平均長(zhǎng)度，平均GC含量為60.014%，說(shuō)明該基因的組裝質(zhì)量合格，效果較好，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)的分析和挖掘。

表2 基因比對(duì)率統(tǒng)計(jì)表 單位：條

表3 組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistical table of assembly quality

2.5 Unigene基本注釋

對(duì)C.laurentii組裝轉(zhuǎn)錄本分別與Nr、KEGG、KOG和Swissprot四大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。測(cè)序得到的7 191個(gè)基因，進(jìn)行基因功能注釋并分別結(jié)果如表4所示，有6 402條(89.03%)Unigene被注釋到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)、5 958條(82.85%)Unigene被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、3 480條(48.39%)Unigene被注釋到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)、3 998條(55.60%)Unigene被注釋到Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)；總共有6 409條(89.13%)Unigene被注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)，沒(méi)有注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的一共有782(10.87%)條。

Nr作為非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)比對(duì)基因序列可以確定物種相似性。由圖3-b可知，C.laurentii與銀耳(Naemateliaencephala)、新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)和白茅草考克娃酵母(Kockovaellaimperatae)的種源相似性最高，分別為996(15.56%)、817(12.76%)、768(11.20%)，表明C.laurentii與酵母有較高的種源相似性。

表4 功能注釋統(tǒng)計(jì)表Table 4 Statistical table of function notes

2.6 CMC誘導(dǎo)C.laurentii差異表達(dá)基因分析

2.6.1 DEGs的篩選

對(duì)于同一生物體而言，在不同的環(huán)境條件下其體內(nèi)的基因表達(dá)會(huì)存在顯著性差異。因此，為了探究C.laurentii在CMC培養(yǎng)條件下基因的表達(dá)的差異情況，對(duì)2處理組樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。篩選標(biāo)準(zhǔn)：FDR<0.05且FC>1(|log2FC|>1)。結(jié)果如圖3-c所示，添加0.5% CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h的C.laurentii總共篩選出顯著性差異表達(dá)基因58個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的有55個(gè)基因，占比為94.83%，3個(gè)基因?yàn)橄抡{(diào)表達(dá)，占比僅有5.17%。

2.6.2 DEGs的GO富集分析

對(duì)所有的DEGs做二級(jí)GO數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析，DEGs被涉及到生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)大類(lèi)，總共包括在24個(gè)二級(jí)亞類(lèi)中(圖4-a)。生物過(guò)程包括12個(gè)亞類(lèi)，其中，以細(xì)胞過(guò)程、單生物過(guò)程和代謝過(guò)程富集的DEGs最多，分別為16、15、13個(gè)，該3個(gè)亞類(lèi)可能與細(xì)胞的能量代謝、生長(zhǎng)等相關(guān)；細(xì)胞組分的包括8個(gè)亞類(lèi)，其中以細(xì)胞、細(xì)胞區(qū)域、膜和細(xì)胞器富集到最多的DEGs，分別為11、11、10、7個(gè)，該4個(gè)亞類(lèi)可能與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)；富集到分子功能的亞類(lèi)數(shù)目最少，僅有4個(gè)，分別為催化活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)體活性和電子轉(zhuǎn)運(yùn)體活性，其參與的DEGs分別為13、9、3、1個(gè)，該4個(gè)亞類(lèi)可能與細(xì)胞內(nèi)酶的合成與電子的傳遞相關(guān)。

a-Unigene長(zhǎng)度分布圖；b-Nr比對(duì)物種數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖；c-DEGs火山圖圖3 Unigene長(zhǎng)度分布圖、Nr比對(duì)物種數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖和DEGs火山圖Fig.3 Diagram of Unigene length distribution、cartograph of the number of Nr comparison specie and volcano map of differential genes

2.6.3 DEGs的KEGG富集分析

在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)共同行使其生物學(xué)功能。KEGG作為主要的基因通路公共數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)篩選出的DEGs注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，能找到相關(guān)DEGs的通路并能夠確定DEGs參與的最主要生化代謝通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。對(duì)本實(shí)驗(yàn)所有DEGs進(jìn)行通路富集分析(圖4)。

a-GO富集分類(lèi)柱狀圖；b-KEGG富集條形圖圖4 GO和KEGG富集分析Fig.4 GO and KEGG enrichment analysis

DEGs被富集到14個(gè)通路上，其中呈顯著富集(Q<0.05)的是氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)和代謝途徑2個(gè)通路，分別富集了7和12個(gè)DEGs；其次，酪氨酸代謝、次生代謝物的生物合成和β-丙氨酸代謝途徑通路上各有2個(gè)DEGs；富集只有1個(gè)DEGs的通路為黃曲霉毒素生物合成、糖胺聚糖降解、苯丙氨酸代謝、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、精氨酸與脯氨酸代謝、甘油脂代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、酵母MAPK信號(hào)通路和酵母細(xì)胞周期通路。其中，OXPHOS通路歸屬于能量代謝亞類(lèi)、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)和酵母MAPK信號(hào)通路歸屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞類(lèi)、酵母細(xì)胞周期通路則歸屬于細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡亞類(lèi)；其4條通路所參與的過(guò)程可能涉及酵母的能量代謝，生長(zhǎng)與繁殖等。

2.7 相關(guān)DEGs的通路分析

由表5可知，在DEGs富集的14條通路中，所有通路中的DEGs都表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)且表達(dá)量均顯著高于未誘導(dǎo)處理，其中與酵母的能量代謝、生長(zhǎng)繁殖相關(guān)的通路，包括OXPHOS、代謝途徑、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、酵母MAPK信號(hào)通路和酵母細(xì)胞周期，差異表達(dá)基因呈現(xiàn)出不同幅度顯著(P<0.05)上調(diào)(表6)。

表5 CMC誘導(dǎo)C.laurentii后的DEGsTable 5 Differential genes of C.laurentii after induction by CMC

由圖5可知，CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)C.laurentiiOXPHOS通路中，基因ND1(NADH-泛醌氧化還原酶鏈1)、ND3(NADH-泛醌氧化還原酶鏈3)、ND4(NADH-泛醌氧化還原酶鏈4)、Cytb(泛醌-細(xì)胞色素c還原酶細(xì)胞色素b亞基)、COX1(細(xì)胞色素c氧化酶亞基1)、COX3(細(xì)胞色素c氧化酶亞基3)和β-a(F型H+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶亞基)的表達(dá)量均上調(diào)；經(jīng)誘導(dǎo)后，其表達(dá)量均顯著(P<0.05)高于未誘導(dǎo)處理，其分別提高48.86、2.56、25.62、28.03、15.38、35.03、21.53倍(表6)。C.laurentii的磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)通路中，與鈣離子相關(guān)基因CALM(鈣調(diào)蛋白)為上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量增加了1.89倍，顯著(P<0.05)高于未誘導(dǎo)處理(表6)。此外，經(jīng)過(guò)CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)后，在C.laurentii的MAPK信號(hào)通路和細(xì)胞周期通路中，與細(xì)胞周期和有絲分裂相關(guān)的基因MIH1(M期誘導(dǎo)酪氨酸磷酸酶)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量高于未誘導(dǎo)處理2.05倍，差異達(dá)顯著(P<0.05)水平(表6)。

表6 CMC誘導(dǎo)C.laurentii與細(xì)胞能量代謝、生長(zhǎng)相關(guān)的DEGs表達(dá)量Table 6 CMC induces differential gene expression in C.laurentill associated with cellular energy metabolism and growth

圖5 OXPHOS通路Fig.5 Oxidative phosphorylation pathway

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)C.laurentii進(jìn)行CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)，結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中添加CMC培養(yǎng)，C.laurentii形態(tài)由正圓形向橢圓形變化，誘導(dǎo)培養(yǎng)24～72 h酵母形態(tài)變化率顯著(P<0.05)高于對(duì)照處理，推測(cè)這個(gè)過(guò)程汲及到細(xì)胞的分裂。進(jìn)一步對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h形態(tài)發(fā)生顯著差異變化的酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果表明，經(jīng)CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)的C.laurentii，與對(duì)照組相比，C.laurentii共有58個(gè)DEGs，其中55個(gè)為上調(diào)表達(dá)，3個(gè)為下調(diào)表達(dá)。DEGs被注釋到24條GO分類(lèi)中和14條KEGG通路中，分析結(jié)果表明，0.5% CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)24 hC.laurentii涉及的DEGs功能主要與細(xì)胞能量代謝和生長(zhǎng)、繁殖等有關(guān)，顯著(P<0.05)富集在OXPHOS、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、酵母MAPK信號(hào)通路和酵母細(xì)胞周期通路中。

在能量代謝方面，OXPHOS是需氧細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞能量來(lái)源的主要途徑，能生成大量的ATP[12]，其由電子傳遞酶類(lèi)(復(fù)合物I～Ⅳ)協(xié)同作用工作，復(fù)合物I～Ⅳ是由多亞基酶構(gòu)成并協(xié)同作用與工作，而后在A(yíng)TP合酶(復(fù)合物Ⅴ)的作用下產(chǎn)生ATP[13]，因此，該途徑能夠?yàn)榧?xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖提供能量支持。OXPHOS代謝途徑中，復(fù)合物Ⅰ又稱(chēng)還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶，是呼吸鏈中最大的酶[14]，其能夠轉(zhuǎn)移電子給輔酶Q，利于電子的轉(zhuǎn)移，最終促使質(zhì)子泵入線(xiàn)粒體膜間隙。ND1(NADH-泛醌氧化還原酶鏈1)、ND3(NADH-泛醌氧化還原酶鏈3)、ND4(NADH-泛醌氧化還原酶鏈4)為NADH脫氫酶下的3個(gè)酶鏈，他們的聚集組合對(duì)NADH的產(chǎn)生具有重要的調(diào)控作用。本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，基因ND1、ND3和ND4在CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)后呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，與NADH合成積累密切相關(guān)。復(fù)合物Ⅲ又名細(xì)胞色素c還原酶，其將電子從輔酶Q傳遞給細(xì)胞色素c，有助于質(zhì)子傳遞進(jìn)入膜間隙。主要參與了細(xì)胞呼吸、生物大分子合成等過(guò)程[15]，對(duì)于酵母的生殖生長(zhǎng)和代謝起著至關(guān)重要的作用。亞基基因Cytb(泛醌-細(xì)胞色素c還原酶細(xì)胞色素b亞基)是調(diào)控復(fù)合物Ⅲ合成的核心構(gòu)件關(guān)鍵基因。發(fā)現(xiàn)CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)后，C.laurentii的Cytb基因表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)，說(shuō)明該基因參與了復(fù)合物Ⅲ積累，從而促進(jìn)電子向載體細(xì)胞色素c的轉(zhuǎn)移。復(fù)合物Ⅳ又稱(chēng)細(xì)胞色素c氧化酶，線(xiàn)粒體呼吸鏈的最后一種酶[16]，它接受來(lái)自細(xì)胞色素c的電子，把電子傳遞給O2轉(zhuǎn)化為H2O，將質(zhì)子泵送至膜間隙。COX1(細(xì)胞色素c氧化酶亞基1)、COX3(細(xì)胞色素c氧化酶亞基3)作為細(xì)胞色素c氧化酶下的2個(gè)亞基，具有參與、穩(wěn)定催化及調(diào)節(jié)活性的功能，對(duì)復(fù)合物Ⅳ的積累起到重要調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，C.laurentii的COX1和COX3基因在CMC誘導(dǎo)后呈現(xiàn)不同幅度上調(diào)，推測(cè)添加CMC培養(yǎng)誘導(dǎo)酵母COX1、COX3基因表達(dá)，使酵母胞內(nèi)細(xì)胞色素c氧化酶相對(duì)含量增加，有利于胞內(nèi)電子的大量傳遞轉(zhuǎn)移。復(fù)合物Ⅴ又名ATP合酶，作為酵母能量代謝的關(guān)鍵酶，其利用復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ產(chǎn)生的質(zhì)子動(dòng)力將ADP合成ATP，為細(xì)胞內(nèi)多種化學(xué)反應(yīng)和功能的進(jìn)行提供能量[17]。本研究轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)顯示，ATPase編碼基因β-a(F型H+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶亞基)在CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)后表達(dá)量上調(diào)，β-a作為復(fù)合物Ⅴ的1種亞基組件對(duì)于A(yíng)TP合酶的組裝合成具有促進(jìn)作用，進(jìn)一步利于A(yíng)DP和Pi(無(wú)機(jī)磷酸鹽)在線(xiàn)粒體內(nèi)膜上凝聚合成ATP[18]?；谝陨戏治鐾茰y(cè)，CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)C.laurentii，酵母ND1、ND3、ND4、Cytb、COX1、COX3和β-a基因表達(dá)量均上調(diào)，促進(jìn)復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ積累，提高酵母細(xì)胞ATP的合成能力，為酵母細(xì)胞內(nèi)各種代謝反應(yīng)和物質(zhì)合成提供能量保證，進(jìn)而增強(qiáng)酵母的活力，上述研究結(jié)果與宋志強(qiáng)等[19]的研究結(jié)果類(lèi)似。

CMC誘導(dǎo)培養(yǎng)提高C.laurentii生長(zhǎng)繁殖能力，拮抗酵母的生長(zhǎng)繁殖能力與其生防效力密切相關(guān)[20]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析得出，磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)通路中，基因CALM(鈣調(diào)蛋白)表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)，該研究結(jié)果與韓秀娟等[21]的研究結(jié)果類(lèi)似。CALM是真核細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)鈣信號(hào)通路的一種關(guān)鍵蛋白[22]，其作為調(diào)節(jié)因子并幾乎存在于每一種細(xì)胞內(nèi)[23]。CALM作為酵母細(xì)胞內(nèi)Ca2+的主要受體，其功能主要是參與促進(jìn)細(xì)胞的新陳代謝、細(xì)胞分裂、生殖生長(zhǎng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列過(guò)程[24]。此外，在酵母MAPK信號(hào)通路和酵母細(xì)胞周期通路中，MIH1(M期誘導(dǎo)酪氨酸磷酸酶)的表達(dá)量上調(diào)。MIH1p是一種控制細(xì)胞周期的蛋白酪氨酸磷酸酯酶，其通過(guò)調(diào)節(jié)Cdc28p的磷酸化程度影響酵母的有絲分裂。其與基因Swe1p共同形成有絲分裂的負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)[25]。有研究表明，基因MIH1缺失的情況下，細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的時(shí)間會(huì)延遲，而且細(xì)胞的體積會(huì)變大[26]，本研究轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)表明，MIH1上調(diào)表達(dá)加速細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程，根據(jù)該結(jié)果推測(cè)細(xì)胞形態(tài)呈橢圓形態(tài)變化(圖2-b)，可能是酵母進(jìn)行大量有絲分裂活動(dòng)，兩者結(jié)果基本相符，其研究結(jié)果與PAL等[26]研究類(lèi)似。因此，CMC誘導(dǎo)C.laurentii使酵母CALM、MIH1的表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)酵母細(xì)胞的有絲分裂及生殖生長(zhǎng)，提升酵母自身增殖與代謝效率，從而增強(qiáng)了其拮抗效力。上述研究結(jié)果為多糖誘導(dǎo)提高生防酵母拮抗效力分子機(jī)制的進(jìn)一步深入研究提供了一定理論參考與及科學(xué)依據(jù)。