童春梅， 易文瑾， 馬 瓊， 鄧惠敏， 朱子丹

(華南師范大學生命科學學院/華南師范大學昆蟲科學與技術研究所/廣東省昆蟲發(fā)育調控與應用重點實驗室， 廣州 510631)

昆蟲的變態(tài)發(fā)育主要由保幼激素(Juvenile Hormone,JH)和蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)共同調控。JH幾乎存在于所有昆蟲的幼蟲期,在變態(tài)前維持個體生長發(fā)育水平,阻止幼蟲提前成熟變態(tài)[1-2]，而JH在幼蟲末齡期的下降則使20E可誘導蛻皮變態(tài)[3]。JH在昆蟲的發(fā)育過程中具有重要作用,然而JH信號通路的分子作用機制研究經歷了漫長的時間,主要原因為其JH受體難以確定[4]。

經過多年的研究,學者們發(fā)現(xiàn)了2個JH可能的受體：Met(Methoprene-tolerant)[4-7]和gce(germ-cell express)[8-9]。Met是一個能編碼bHLH-PAS結構域從而結合DNA的轉錄因子，最早是在果蠅(Drosophilamelanogaster)中發(fā)現(xiàn)并克隆的[5]。隨后，在尖音庫蚊(Culexpipiens)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)、岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)和赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)等昆蟲中也克隆到了DmMet相應的同源體，這些同源基因所編碼的蛋白都含有典型的bHLH-PAS結構域，暗示Met在不同昆蟲中的功能可能比較保守[6-7]。 后期研究發(fā)現(xiàn)：果蠅中還存在另一個JH可能的受體gce，其基因序列與Met具有高度同源性，且同樣編碼一個含有bHLH-PAS結構域的轉錄因子，可以與DmMet形成同源或異源二聚體[8-9]；在果蠅中，gce能夠在體內發(fā)揮Met的作用[10],且只有在Met和gce同時突變時果蠅才致死，二者都具有在幼蟲蛻皮時通過誘導Kr-h1的表達來阻止20E誘導的組織細胞凋亡的功能[11]。在赤擬谷盜中，利用RNAi技術對TcMet進行干擾，結果使得赤擬谷盜幼蟲產生了對JH的抗性，并引起了幼蟲的早熟變態(tài)[7,12]。這一結果表明：TcMet在赤擬谷盜JH通路中起著重要的信號傳導作用。通過比對家蠶基因組數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，在家蠶中有2個果蠅Met同源基因，分別為BmMet1和BmMet2[13]。本實驗室前期已經對BmMet1進行了克隆和表達定位分析，結果顯示：BmMet1基因mRNA的轉錄和蛋白表達均在家蠶5齡中后期和吐絲期的翅原基組織中呈現(xiàn)較高水平，而在蛹期呈現(xiàn)較低水平，且受到JH類似物Methoprene的誘導上調表達[14]，所以本文主要以BmMet2為研究對象。

家蠶翅原基在5齡之前生長緩慢，在5齡中期迅速發(fā)育，其5齡后期時的大小形態(tài)已基本接近蛹期[15]，表明5齡時期的翅原基發(fā)育主要受JH的調控。然而，被認為是JH受體的Met2是否參與翅原基的發(fā)育過程仍不清晰，本研究通過比對家蠶基因組數(shù)據(jù)庫，找到了果蠅Met和gce的同源基因BmMet2[13]，克隆表達了BmMet2中能與DNA結合的蛋白區(qū)域BmMet2DBD，并制備了可特異性識別BmMet2的抗體，利用蛋白質印跡法(Western blotting)檢測了BmMet2在翅原基各時期的表達，免疫組化檢測了BmMet2在各組織中的定位表達情況，以期為研究BmMet2作為JH的受體是否參與調控家蠶的生長發(fā)育(尤其是翅原基發(fā)育)提供基礎，以及為闡明昆蟲變態(tài)發(fā)育的分子調控機制、促進蠶絲產業(yè)的發(fā)展和為鱗翅目害蟲防治等提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的家蠶品種為大造，由廣東省農業(yè)科學院蠶業(yè)與農產品加工研究所提供。在溫度26±1 ℃、相對濕度為65%～75%、光周期為12 h∶12 h (光∶暗)的培養(yǎng)箱中，用新鮮采摘的桑葉飼養(yǎng)幼蟲。

1.2 方法

1.2.1 激素處理與基因表達量檢測 選取5齡第3天的家蠶，在其第2、3胸節(jié)處分別注射2 μg的JH類似物Methoprene或20E，另外注射相同體積的w=0.1%的DMSO 作為對照組。在1、2、4、8、16、32 h后分離翅原基。按Trizol Isolate抽提試劑盒的說明提取家蠶組織RNA，然后按照TAKARA公司的M-MLV反轉錄試劑盒說明書，反轉錄合成cDNA，制備家蠶各發(fā)育時期(5齡第3天至蛹期第3天)翅的cDNA和激素處理后翅的cDNA。根據(jù)序列設計PCR引物(表1)，參照熒光定量PCR試劑盒的方法，進行PCR反應，檢測BmMet2的表達。

表1 本研究所使用到的引物Table1 The primers used in this study

1.2.2 基因克隆與表達載體構建 根據(jù)序列設計PCR引物(表1)，以家蠶cDNA為模版，進行PCR擴增。將純化后的PCR產物與pMD18-T載體連接，轉化到E.coliDH5α菌體中，篩選陽性克隆進行測序確認。用EcoRⅠ和XhoⅠ對BmMet2DBD片段和pProEx-HTa進行雙酶切，膠回收后將回收片段進行連接，構建BmMet2DBD-pProEx-HTa表達載體，然后轉化至DH5α中。將過夜培養(yǎng)后的細菌按1∶100的體積比加入LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、220 r/min；當菌液的OD值達到0.4～0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。實驗對照為相同培養(yǎng)條件下的不含目的基因的空載。4 ℃、12 000 r/min離心1 min收集菌體，超聲波進行破碎，離心后分別收集上清液和沉淀。最后進行w=10%的SDS-PAGE凝膠電泳后考馬斯亮藍R250染色分析。

1.2.3 抗體制備及檢測 將500 μg 溶于PBS的BmMet2DBD重組蛋白與等量的弗氏完全佐劑充分混合。用注射器抽取乳化液，皮下注射新西蘭大白兔；每隔一個星期，用300 μg蛋白與弗氏不完全佐劑的混合液對兔子進行3次加強免疫。在第3次加強免疫7天后，在兔子耳朵靜脈近末端抽取血液。采集的血液在37 ℃培養(yǎng)箱中放置1 h，然后在4 ℃條件下放置過夜；第2天，10 000 r/min離心10 min，收集上清液，分裝放在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用Western blotting檢測抗體效價。

1.2.4 Western blotting實驗 使用w=10%的SDS-PAGE電泳分離蛋白，每一個泳道蛋白上樣量為15 μg。使用電轉系統(tǒng)將分離膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，隨后將膜放入w=3%的BSA中4 ℃封閉過夜，按1∶1 000的比例加入BmMet2抗體，37 ℃孵育1 h。用洗脫液洗膜3次去除未結合的抗體。以1∶10 000稀釋比例加入堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG酶標抗體，于37 ℃孵育1 h。洗脫液洗膜4次后用四唑硝基藍(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)混合進行顯色。

1.2.5 BmMet2在家蠶組織中表達的免疫組化分析 將5齡第6天、吐絲期及預蛹期的家蠶置于冰上，等其凍至休克后從頭部注入φ=4%的多聚甲醛，隨后分別取其第2、3胸節(jié)放入φ=4%的多聚甲醇固定過夜。將固定好的樣品分別用φ=50%，70%，85%，95%，100%的乙醇梯度脫水，每次1 h，最后用φ=100%的二甲苯透明。將上述處理好的樣品在60 ℃的石蠟中滲蠟2 h，將熔化好的石蠟與組織放進包埋架中調整好位置，等石蠟凝固，4 ℃冷卻后即可取出蠟塊進行切片。

將切片于二甲苯和乙醇梯度體積分數(shù)下脫蠟，使用φ=3%的H2O2室溫下孵育5 min，20 mg/mL蛋白酶K反應15 min；用預冷的0.2 mol/L甘氨酸溶液孵育2 min；孵育后用PBS緩沖液洗5 min，共洗3次；用w=5%的BSA的封閉液37 ℃下孵育過夜；用PBS 洗滌3次；按1∶200的比例加入一抗(可特導性識別BmMet2的抗體)，在37 ℃中孵育1 h；用PBS 洗5 min，共洗3次；每一塊載玻片上加入40～50 μL 異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔的二抗和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)的混合液，避光孵育30 min；PBS洗滌5 min，共洗3次；最后，在倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 實驗結果

2.1 家蠶 BmMet2蛋白的序列分析

從NCBI上獲得BmMet2蛋白序列(Accession number:NP_001108457.1)，用SMART軟件(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)對家蠶BmMet2的蛋白序列進行分析預測。結果(圖1)顯示：BmMet2編碼1個bHLH-PAS型轉錄因子和1個PAC基序。bHLH是能與DNA結合的結構域，而PAS結構域能與其他bHLH-PAS超家族成員發(fā)生蛋白-蛋白相互作用。這暗示了BmMet2能與DNA結合并與其他轉錄因子互作，共同調控下游基因的表達。

圖1 BmMet2蛋白的序列分析

2.2 BmMet2時期表達譜及激素誘導表達分析

qRT-PCR結果(圖2A)表明：在翅原基中，BmMet2在 5齡第3天和5齡第6天有較高水平的表達；到游走期，其表達水平有些下降；化蛹后，其表達水平持續(xù)下降，至蛹期第3天時已下降到較低水平。這一表達變化趨勢與保幼激素JH在家蠶體內的滴度變化趨勢[16]相一致，表明BmMet2可能參與JH對翅原基發(fā)育的調控。激素處理實驗結果(圖2B)顯示BmMet2均受到JH和20E的誘導表達且JH類似物Methoprene的誘導作用更明顯：(1)在JH注射后1～2 h,BmMet2表達上調;處理2 h后，激素誘導效應不再明顯。(2)注射20E 1 h后亦可誘導BmMet2表達，至2 h時則顯著抑制表達。這些結果表明，BmMet2可能作為JH的響應因子，參與了JH對翅原基發(fā)育的調控，且也能受20E的誘導表達，在復雜的JH和20E互作網絡中也可能發(fā)揮重要的作用。

圖2 BmMet2在翅原基中的時期表達譜及激素誘導表達分析

2.3 重組蛋白BmMet2DBD的原核表達及多克隆抗體的特異性

根據(jù)NCBI上BmMet2(Accession number:NM_001114985.1)的cDNA序列設計引物，擴增BmMet2中能與DNA結合的序列(BmMet2DBD)(圖3A)，經過w=1%的凝膠電泳分離后，在1 000 bp附近顯示出一條特異性條帶，與預測條帶長度1 062 bp相符，經序列測定證明克隆的序列正確(圖3B)。對BmMet2DBD進行結構分析，BmMet2DBD具有1個HLH結構域、1個PAS結構域和1個PAC基序。

圖3 BmMet2DBD的cDNA序列和PCR擴增產物

將重組質粒BmMet2DBD-pProEx-HTa轉化入DH5α，經IPTG誘導4 h后，收集細菌進行超聲波破碎離心，分離上清液和沉淀用于SDS-PAGE檢測。pProEx-Hta含有1個His標簽，其相對分子質量為3 000，而BmMet2DBD重組蛋白的相對分子質量約為38 400，所以預測重組表達蛋白的相對分子質量約為41 400。結果(圖4A)顯示：重組質粒表達出重組蛋白，其相對分子質量與預測相對分子質量(41 400)非常相近，這表明BmMet2DBD重組蛋白在原核系統(tǒng)中成功表達，且主要以包涵體的形式存在于沉淀中。

用BmMet2DBD重組蛋白免疫新西蘭大白兔后，獲得相應的BmMet2DBD多克隆抗體，并用BmMet2DBD-pPROEX-HTa轉化的細菌總蛋白進行Western blotting實驗，對抗體進行專一性分析。結果(圖4B)表明所制備的抗體能很好地識別抗原蛋白：制備的抗體能檢測到BmMet2DBD-pPROEX-HTa轉化的細菌總蛋白中的特異性蛋白條帶，而在pPROEX-HTa菌體總蛋白中沒有檢測到蛋白條帶。

圖4 重組蛋白 BmMet2DBD的表達及BmMet2DBD抗體的專一性分析

2.4 BmMet2蛋白在家蠶各發(fā)育時期翅原基中的表達

為探究BmMet2的功能，用Western blotting檢測了BmMet2在家蠶不同發(fā)育時期翅原基組織中的表達，每一個泳道蛋白上樣量均為15 μg。結果(圖5)顯示：從家蠶5齡第3天到熟齡期，BmMet2的表達量逐漸升高；在游走期第1天和預蛹期，其表達量達到峰值；預蛹期后，其表達量逐漸降低。游走期和預蛹期是家蠶變態(tài)發(fā)育的重要時期，BmMet2在這2個時期的高表達說明其很可能是參與調控家蠶變態(tài)發(fā)育的重要的轉錄因子。

圖5 BmMet2蛋白在家蠶翅原基中各個時期表達的分析

2.5 BmMet2蛋白的組織定位

為了確定BmMet2蛋白在家蠶組織中的定位，選取5齡第6天、吐絲期和預蛹期的家蠶制備石蠟切片，用熒光免疫組織化學的方法檢測BmMet2蛋白在蠶體主要部位的表達。結果表明：BmMet2蛋白在幼蟲5齡第6天和吐絲期的家蠶胸節(jié)表皮、脂肪體及翅原基的翅囊和翅芽等組織中都有表達，其中在胸節(jié)表皮、脂肪體和翅原基的翅囊等組織部位的表達量較高，在翅原基的翅芽部位的表達量較低(圖6A、B)；BmMet2蛋白在預蛹期的家蠶胸節(jié)表皮、脂肪體及翅原基的翅芽等組織中也有表達，但在翅芽部位的表達量高于幼蟲5齡第6天和吐絲期的(圖6C)。總體來看，BmMet2蛋白在這3個時期都有較高的表達水平，且表達趨勢與Western blotting檢測蛋白質的表達趨勢基本吻合。

圖6 BmMet2蛋白在不同發(fā)育時期和組織中的免疫組織化學定位分析

3 討論與結論

昆蟲的變態(tài)發(fā)育主要由20E和JH通路協(xié)同調控的。目前，關于20E是如何調控昆蟲蛻皮、變態(tài)的分子機制已比較清楚[16]，而JH調控昆蟲生長發(fā)育的分子機制還不是很明確，尤其是其受體和下游調控基因的鑒定較少。Met基因具有典型的DNA結合結構域，果蠅DmMet可以與JH主要種類(JHIII)特異性結合，并具有很高的親和力。在赤擬谷盜中，RNAi干擾TcMet的表達，使得赤擬谷盜幼蟲無法響應JH的調控，并導致了幼蟲的早熟變態(tài)[7,12]，在家蠶中亦有研究表明JH通過與Met和SRC形成復合體，調控JH初級應答因子Kr-h1的轉錄[9]。表明Met可能是JH的受體，并在JH通路中起重要的調控作用。

為了進一步研究BmMet在家蠶生長發(fā)育過程中的作用，本文對BmMet2蛋白進行了結構分析，用qRT-PCR檢測了BmMet2在家蠶翅原基組織中的表達情況及其對昆蟲激素的響應情況；克隆表達了BmMet2中能與DNA結合的蛋白區(qū)域BmMet2DBD；制備了可特異性識別BmMet2的抗體，利用該抗體進行Western blotting和免疫組化實驗，檢測了BmMet2在家蠶各個組織各個時期中的定位表達情況。主要結論如下：

(1)蛋白結構分析結果顯示：BmMet2屬于bHLH-PAS轉錄因子，含有可與DNA結合的bHLH、可與蛋白互作的PAS及PAC結構域。此結果與黑腹果蠅的Dmgce與DmMet都含有bHLH和PAS結構域的結論[6,17]一致。在埃及伊蚊和赤擬谷盜等昆蟲基因組中也鑒定出Met相應的同源基因，發(fā)現(xiàn)這些基因都含有典型的bHLH-PAS結構[7]，說明Met在不同昆蟲中的功能可能是比較一致的。果蠅Met和gce可以相互結合形成Met-Met和Met-gce同源或異源二聚體[8]，這些結果暗示BmMet2可能以同源或異源二聚體的形式參與調控靶基因的表達。

(2)在翅原基中，BmMet2在5齡第3天和5齡第6天有較高水平的表達，隨后表達量降低，其表達模式與家蠶5齡幼蟲發(fā)育過程中JH的滴度相吻合[18]，且家蠶5齡時期翅原基的發(fā)育主要受JH的調控[15]，暗示BmMet2參與了5齡幼蟲的發(fā)育過程，并對翅原基的發(fā)育有重要的作用。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)BmMet2蛋白在5齡第6天、吐絲期和預蛹期的家蠶胸節(jié)表皮、脂肪體及翅原基的翅囊和翅芽等組織中都有較高表達。游走期和預蛹期是家蠶變態(tài)發(fā)育的重要時期，BmMet2在這2個時期的高表達說明其很可能是參與調控家蠶變態(tài)發(fā)育的重要的轉錄因子。

(3)進一步激素處理結果表明BmMet2可能參與了JH對翅發(fā)育的調控，在20E和JH的信號通路過程中發(fā)揮作用：BmMet2的表達受到昆蟲激素Methoprene和20E的誘導，Methoprene的誘導作用比20E的作用更為明顯；2種激素均在注射2 h內誘導基因表達的上調。RIDDIFORD[19]的研究表明Met與FKBP39、Chd64相互作用,并結合于JH應答元件(JHRE)上，從而誘導JH應答基因的大量表達，并與20E誘導的基因一起調控昆蟲的幼蟲蛻皮。LI等[20]在研究果蠅時發(fā)現(xiàn)，當僅存在20E時，Met可與EcR-USP受體二聚體相互作用形成復合物，然后結合于20E的反應元件上，調控20E所誘導的靶基因的轉錄表達。這些前期研究結果與本文得到的2種激素均能誘導BmMet2表達的結果相一致，表明20E受體二聚體EcR-USP和JH受體Met在20E和JH的協(xié)同作用中發(fā)揮至關重要的調控作用。Met通過JH和20E信號通路調控著昆蟲的生長發(fā)育，但其具體的分子作用機制還需進一步深入研究。

綜上所述，本文對轉錄因子BmMet2的研究有助于闡述昆蟲變態(tài)發(fā)育的過程，也有助于完善昆蟲激素對翅原基發(fā)育的分子調控機制。