彭韻樸 周玨珉

(遂寧市中心醫(yī)院心臟電生理室，四川 遂寧 629000)

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是全球人類死亡的頭號(hào)病因，《中國心血管健康與疾病報(bào)告2020》表明，2018年中國農(nóng)村居民CVD死亡率為46.66%，城市為43.81%，高于腫瘤及其他疾病[1-2]。近20年來，碳納米材料[包括石墨烯、碳納米管(carbon nanotubes，CNT)、富勒烯、納米金剛石及其衍生物]在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值，掀起了研究熱潮。下面對(duì)碳納米材料(carbon nanomaterials，CNMs)在CVD診斷治療方面的應(yīng)用和挑戰(zhàn)進(jìn)行綜述，以期為CVD治療提供先進(jìn)、有效的途徑。

1 CNMs結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

碳具有4個(gè)價(jià)電子，可通過spn(n=1，2或3)雜化軌道形成強(qiáng)共價(jià)鍵和弱π-π鍵，排列成零維(富勒烯)、一維(CNT)、二維(石墨烯)以及三維(金剛石)等不同碳同素異形體，具有獨(dú)特的物理、電學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，如大的表面積、高的機(jī)械完整性以及優(yōu)異的導(dǎo)電性和導(dǎo)熱性，成為心血管治療的最佳生物材料。

1.1 石墨烯

石墨烯是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的碳同素異形體之一，具有二維層狀平面結(jié)構(gòu)，每個(gè)碳原子以0.142 nm的間隔排列在蜂窩狀晶格中。石墨烯厚度為單個(gè)原子，彈性模量為0.5～1.0 Tpa，極限拉伸強(qiáng)度為130 GPa，結(jié)構(gòu)中的長程共軛π鍵使其具有優(yōu)異的力學(xué)、熱學(xué)和電學(xué)性能。通常單層石墨片不能穩(wěn)定存在，大量的石墨烯層通過弱范德華力連接組成石墨[3-4]。

石墨烯衍生物主要包括氧化石墨烯(graphene oxide，GO)、還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide，rGO)和石墨烯量子點(diǎn)(graphene quantum dots，GQD)。疏水性和分散穩(wěn)定性差等缺陷阻礙了天然石墨在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。通過改進(jìn)的Hummers方法可制得GO，使其具有更優(yōu)越的分散性。此外，GO納米片邊緣的開放羥基增加了其功能化能力、柔性加工性、兩親性和熒光猝滅能力，有助于創(chuàng)造出更好的復(fù)合材料。將GO還原去除含氧官能團(tuán)，可得到還原態(tài)rGO，最大程度保留原始石墨烯的性質(zhì)以及GO的親水性，但合成過程為rGO帶來很多缺陷，使其成為一種區(qū)別于兩種碳材料的獨(dú)特的碳同素異形體。通過自上而下法和自下而上法可制得GQD，它具有更優(yōu)良的電學(xué)和光學(xué)性能。石墨烯類納米材料擁有大量的官能團(tuán)，如-COOH、-OH和-COC，通過共價(jià)或非共價(jià)與很多美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的聚合物功能化，既能提高心臟細(xì)胞等靶細(xì)胞的特異性，又能減少毒性。

1.2 CNT

CNT是由石墨烯片制成的長而中空的圓柱形管狀結(jié)構(gòu)，具有較高的縱橫比，直徑為1～20 nm，長度可為數(shù)厘米。根據(jù)石墨烯片的層數(shù)，CNT可分為單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes，SWCNT)和多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNT)。SWCNT在電學(xué)上可進(jìn)一步分為半導(dǎo)體單壁碳納米管和金屬單壁碳納米管[5]。與SWCNT相比，MWCNT更容易實(shí)現(xiàn)功能化。原始的CNT水溶性差，具有高度聚集性。將CNT表面-OH、-COOH或-NH2等基團(tuán)官能化能提高其在水中的溶解性和分散性，與生物相容性聚合物進(jìn)一步官能化可解決毒性問題。

1.3 富勒烯

富勒烯是由六角環(huán)和五角環(huán)相連的石墨烯片組成的空心球形、橢球形或管狀結(jié)構(gòu)，分子組成為C2n(n為≥10的整數(shù))。其中C60最常見，擁有30個(gè)碳碳雙鍵，可通過氫化、氧化、鹵化和光敏化等各種反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，是理想的藥物設(shè)計(jì)載體材料。C70呈卵形結(jié)構(gòu)，分子中間多了一個(gè)六角形環(huán)帶，降低了富勒烯籠的對(duì)稱性，但理化性質(zhì)與C60相似。此外，還發(fā)現(xiàn)了其他較小的亞穩(wěn)物種，如C28、C36和C50，以及含有100個(gè)或更多碳原子的巨型富勒烯。

1.4 納米金剛石

納米金剛石顆粒呈球形或準(zhǔn)球形，粒徑范圍為2～20 nm，比表面積大，兼具金剛石和納米材料特性。與其他CNMs不同，納米金剛石具有高度的生物相容性和相對(duì)安全性，因而在藥物載體、生物成像和熒光探針等生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值日益凸顯。

2 CNMs在心血管組織工程中的應(yīng)用

2.1 藥物/生物分子傳遞

新型納米藥物遞送系統(tǒng)解決了傳統(tǒng)方法生物利用度差、藥物毒性大、靶向性缺乏以及給藥頻繁等問題。CNMs小粒徑、高比表面積、優(yōu)異的載藥量以及易于表面功能化等優(yōu)點(diǎn)使其成為有效的納米藥物/基因載藥工具。圖1展示了藥物傳遞系統(tǒng)中常用的CNMs，及有效傳遞目標(biāo)分子到心臟靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。

圖1 CNMs作為載體將藥物/基因?qū)胄募〖?xì)胞的不同機(jī)制示意圖

原始石墨烯載藥能力有限，GO和rGO成為首選載體，功能化后石墨烯的毒性、靶向性和緩釋性得到很好的改善。Kaya等[6]將厄貝沙坦裝載到由rGO、透明質(zhì)酸、明膠和聚環(huán)氧乙烷組成的導(dǎo)電聚合物膜上，能有效地控釋藥物。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelium growth factor，VEGF)可誘導(dǎo)缺血心肌組織的血管生成。Paul等[7]將聚乙烯亞胺功能化GO與VEGF-165促血管生成基因(DNAVEGF)結(jié)合成非病毒基因遞送系統(tǒng)(fGOVEGF)，并將其摻入低模量甲基丙烯酸明膠(methacrylic gelatin，GelMA)水凝膠中，用于急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)局部基因治療。結(jié)果fGOVEGF/GelMA組AMI大鼠梗死周圍區(qū)域的心肌毛細(xì)血管密度顯著增加，瘢痕面積減少，表明fGOVEGF/GelMA基因治療系統(tǒng)治療缺血性心臟病具有可行性。

原始的CNT分散性差，載藥量小，無法用作載藥載體。采取摻雜等手段對(duì)CNT和藥物進(jìn)行功能化可有效改善藥物在CNT表面的吸附，為缺血組織傳送藥物以促進(jìn)血管生成。Masotti等[8]用聚乙烯亞胺/聚氨基胺樹狀大分子功能化CNT，能有效地傳遞miR-503并改善血管生成。此外，CNT還被用于涂層支架，防止支架內(nèi)再狹窄。Ul Haq等[9]設(shè)計(jì)了一種聚丙烯酸包裹的SWCNT復(fù)合材料，與VEGF、血管生成素-1和內(nèi)溶Tat肽制成纖維蛋白水凝膠，可改善再內(nèi)皮化，阻止新生內(nèi)膜的形成，防止損傷動(dòng)脈段的狹窄。

直徑約0.7 nm的穩(wěn)定籠狀分子，有助于富勒烯被動(dòng)擴(kuò)散到細(xì)胞和細(xì)胞核中，以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。Hao等[10]發(fā)現(xiàn)富勒烯-C60可改善大鼠心肌細(xì)胞特異性蛋白[心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin，cTn)T和α-肌節(jié)肌動(dòng)蛋白]的表達(dá)，調(diào)節(jié)棕色脂肪干細(xì)胞增殖和心肌分化，這些發(fā)現(xiàn)對(duì)富勒烯在AMI治療中的臨床應(yīng)用具有重要意義。

2.2 生物傳感器

生物傳感器可早期檢測(cè)心臟生物標(biāo)志物和連續(xù)監(jiān)測(cè)CVD，以便及時(shí)治療和保存心臟功能。由于低成本、高表面體體積比、較小尺寸以及獨(dú)特的電學(xué)和光學(xué)特性，CNMs成為CVD診斷生物傳感器的理想材料。AMI時(shí)，瀕死的心肌細(xì)胞會(huì)釋放肌紅蛋白、肌酸激酶、腦鈉肽和cTn等標(biāo)志物，穩(wěn)定而靈敏地檢測(cè)這些標(biāo)志物是CVD早期診斷的關(guān)鍵。Demirbakan等[11]制備了鹽酸修飾超靈敏石墨紙電極，用cTnT抗體對(duì)其進(jìn)行功能化，以檢測(cè)人血清中cTnT水平，實(shí)現(xiàn)亞飛秒級(jí)檢測(cè)。金屬和納米金屬硫系化合物具有優(yōu)異的電催化活性、機(jī)械剛度和快速電荷轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)，是摻雜或功能化石墨烯電極的理想材料，可提高心臟生物標(biāo)志物的檢測(cè)靈敏度和選擇性。Chauhan等[12]將rGO與金屬硫系化合物(四硒化鉬，nMo3Se4)包埋在氧化銦錫涂層的玻璃電極中，并用牛血清白蛋白功能化以檢測(cè)cTnI，比常用的氧化鋯電極靈敏度提高9倍。

CNT表面附著生物活性分子能增加對(duì)心臟生物標(biāo)志物的敏感性。Freitas等[13]開發(fā)了一種氨基功能化MWCNT基碳電極，用于人類血清cTnT水平檢測(cè)，檢測(cè)限為0.016 ng/mL，適于體外cTnT檢測(cè)。不同的CNMs生物傳感器具有獨(dú)特的性能，Eissa等[14]比較了六種商用CNMs電極(碳、碳納米纖維、MWCNT、SWCNT、原始石墨烯和GO)檢測(cè)糖化血紅蛋白水平的性能。盡管所有的電極對(duì)生物標(biāo)志物均顯示出良好的選擇性和敏感性，但基于SWCNT的生物傳感器的整體性能最好。未來需對(duì)CNMs介導(dǎo)的CVD診斷機(jī)制進(jìn)行深入研究，以期為CVD的診斷和治療提供最佳的商業(yè)化產(chǎn)品。

目前，碳納米金剛石在心血管領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在生物傳感器的研發(fā)上。Gerstenhaber等[15]制備了熒光碳納米金剛石-bitistatin(F-NDP-Bit)復(fù)合物，用于識(shí)別體內(nèi)血管血栓。Wang等[16]設(shè)計(jì)了一種基于納米金剛石和石墨烯結(jié)構(gòu)的生物傳感器，能檢測(cè)到非常微小的肌紅蛋白(0.01～1 000 pg/mL)。

2.3 組織工程學(xué)

石墨烯非凡的機(jī)械強(qiáng)度加上優(yōu)異的導(dǎo)電性和超大的表面積等特性，可促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和分化。Nazari等[17]將還原的氧化石墨烯銀(rGO-Ag)納米粒子嵌入聚氨酯支架中，然后植入人心臟祖細(xì)胞，可提高人心臟祖細(xì)胞的存活率和生長率，并使心臟特異性基因GATA4、TBX18、cTnT和α-MHC的表達(dá)增強(qiáng)?？勺⑸渌z為3D交聯(lián)聚合物，為心肌細(xì)胞的生長和跳動(dòng)提供了自然環(huán)境，其剪切變稀特性使其能將包裹的細(xì)胞安全地注射到受損心肌中，有效促進(jìn)AMI的修復(fù)過程。Bao等[18]以聚乙二醇為交聯(lián)劑，將三聚氰胺與巰基改性透明質(zhì)酸交聯(lián)，制備了一種軟質(zhì)可注射水凝膠，該水凝膠與GO結(jié)合后具有類似心肌的抗疲勞力學(xué)和電學(xué)性質(zhì)。將導(dǎo)電水凝膠包裹于脂肪組織衍生基質(zhì)細(xì)胞中，并注入AMI區(qū)后可使α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和間隙連接蛋白43表達(dá)改善。此外，射血分?jǐn)?shù)、血管密度水平、梗死面積和纖維化程度均有顯著改善。

CNT電化學(xué)穩(wěn)定，可與電活性組織(如神經(jīng)、心臟和骨組織)相互作用，與水凝膠和支架結(jié)合可創(chuàng)造出新型的導(dǎo)電結(jié)構(gòu)用于心臟組織修復(fù)。Ahadian等[19]采用一種人造聚合物和導(dǎo)電CNT來模擬天然細(xì)胞外間質(zhì)，制備了一種具有彈性的導(dǎo)電支架，將新生大鼠心肌細(xì)胞植入支架可提高細(xì)胞活力。Kharaziha等[20]將CNT嵌入明膠納米纖維支架，不同濃度的CNT(0%～1.5%)能顯著增強(qiáng)支架的導(dǎo)電性和韌性，同時(shí)保持了心肌細(xì)胞的活力，可潛在地用作心臟或神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)的移植物。

富勒烯-C60可用作支架增強(qiáng)劑，通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路增強(qiáng)棕色脂肪干細(xì)胞的存活和增殖的能力[10]，為富勒烯-C60通過細(xì)胞療法或組織工程治療AMI的潛在應(yīng)用提供了證據(jù)。此外，富勒烯醇結(jié)合海藻酸鈉水凝膠能有效保護(hù)棕色脂肪干細(xì)胞免受H2O2介導(dǎo)的活性氧的損傷，當(dāng)注射到AMI大鼠的缺血區(qū)域時(shí)，復(fù)合物中棕色脂肪干細(xì)胞的存活率和保留率顯著提高[21]。

2.4 免疫調(diào)節(jié)

AMI后，免疫細(xì)胞在心肌中浸潤有助于心臟組織修復(fù)。石墨烯及其衍生物與聚合物的功能化可提高其生物相容性和對(duì)免疫細(xì)胞的免疫逃避能力。Malanagahalli等[22]研究了少層石墨烯對(duì)小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)少層石墨烯通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入巨噬細(xì)胞后發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞分為M1型與M2型，前者促進(jìn)炎癥并抑制細(xì)胞增殖，后者促進(jìn)增殖和組織修復(fù)，將M1型極化為M2型的免疫療法在心臟修復(fù)方面獲得了極大的關(guān)注。Han等[23]制備了由GO、聚乙烯亞胺、聚乙二醇和葉酸組成的巨噬細(xì)胞靶向/極化氧化石墨烯復(fù)合物，與白介素-4基因特異性結(jié)合以促進(jìn)M1到M2巨噬細(xì)胞的極化。在小鼠AMI模型中，巨噬細(xì)胞靶向/極化GO復(fù)合物的輸送能使M1極化為M2巨噬細(xì)胞，同時(shí)改善活性氧清除特性，減輕纖維化，改善血管生成，保留心臟功能。

CNT固有的免疫原性限制了其在免疫調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用，需通過調(diào)整尺寸、改變理化性質(zhì)和表面功能化等手段降低其免疫原性。CNT的功能化能增加吞噬細(xì)胞和其他細(xì)胞對(duì)CNT的識(shí)別。在一項(xiàng)研究[24]中，磷脂酰絲氨酸修飾的SWCNT被不同的吞噬細(xì)胞(即小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞、原代單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和大鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞)所識(shí)別，磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白Annexin V抑制了巨噬細(xì)胞的攝取，并改變了巨噬細(xì)胞的促炎和抗炎行為。

Bunz等[25]比較了富勒烯-多羥基-C60和N-乙基-聚氨基-C60對(duì)免疫活性細(xì)胞的影響，研究表明兩種富勒烯對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)性無影響，但能激活巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞等免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。Suarez-Kelly等[26]評(píng)估了熒光納米金剛石對(duì)先天免疫細(xì)胞的影響，實(shí)驗(yàn)表明熒光納米金剛石能被吞噬免疫細(xì)胞(RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞和人類單核細(xì)胞)攝取，并激活免疫細(xì)胞。目前，CNMs在免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用還非常有限，需開展更廣泛的基礎(chǔ)研究。

3 CNMs臨床轉(zhuǎn)化的挑戰(zhàn)

納米材料(尺寸1～100 nm)具有獨(dú)特的理化性質(zhì)或生物效應(yīng)，使其在醫(yī)藥、化妝品和電子領(lǐng)域廣泛使用。目前，超過50種含有納米材料的藥物產(chǎn)品被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床，但納米材料的安全性問題也非常值得關(guān)注。將CNMs引入CVD治療還面臨很多挑戰(zhàn)，最主要為細(xì)胞毒性，包括活性氧生成、DNA損傷、溶酶體損傷、線粒體功能障礙以及細(xì)胞凋亡或壞死[27]，毒性與粒徑、形狀、合成方法、表面化學(xué)、劑量和給藥途徑有關(guān)。Chen等[28]研究了不同濃度的GO對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響，在當(dāng)濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，GO使斑馬魚胚胎孵化減慢，體長縮短，心率和血流量改變，凋亡基因表達(dá)增加；濃度為10 mg/L以上時(shí)，毒性與GO的大小無關(guān)。有研究[29]探討了C60水溶性衍生物C60(OH)16-18和3種水懸浮液(nC60/TTA，nC60/甲苯和nC60/aq)對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性，發(fā)現(xiàn)nC60/甲苯、nC60/aq和C60(OH)16-18分別在劑量38 mg/L、5 mg/L和50 mg/L下均未對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育產(chǎn)生毒性，nC60/TTA劑量為1.5 mg/L時(shí)可導(dǎo)致胚胎或幼魚發(fā)育延遲，甚至造成部分斑馬魚心包囊水腫和畸形，表明制備過程以及結(jié)構(gòu)均能影響富勒烯的生物毒性。

2019年，國際化學(xué)品秘書處(ChemSec)將CNT添加到SIN(需立即替換物質(zhì))列表中，原因是具有致癌性和生殖毒性[30]。此外，CNT對(duì)生物降解具有抗性，在水中的半衰期>60 d，在沉積物和土壤中的半衰期>180 d。CNT成為此列表中的首個(gè)納米材料。因此，在產(chǎn)品中應(yīng)避免使用CNT，并探索使用其他方法或可替代的納米結(jié)構(gòu)，以更低的風(fēng)險(xiǎn)提供類似的功能，這限制了CNT在藥物遞送、生物傳感器、各種組織的組織工程應(yīng)用中的應(yīng)用，特別是心臟和大腦等敏感器官。

4 展望

CNMs被譽(yù)為21世紀(jì)的重要材料，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。生物安全性是決定它們能否投入臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。目前對(duì)納米藥物的安全性評(píng)價(jià)多側(cè)重體外細(xì)胞毒性，動(dòng)物毒性評(píng)價(jià)報(bào)道較少。納米藥物在靶組織的毒性、對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響、對(duì)靶組織的致瘤性等方面尚需進(jìn)行深入研究。在未來的安全性評(píng)價(jià)中應(yīng)考慮對(duì)納米材料在環(huán)境中的轉(zhuǎn)歸包括降解性和降解周期，納米藥物的靶向特征以及對(duì)不同生物體影響的差異等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，建立完善的評(píng)價(jià)體系，推動(dòng)納米材料的進(jìn)一步開發(fā)。

心肌血流減少和/或中斷，可引起收縮性心肌細(xì)胞大量不可逆喪失，隨后機(jī)體形成富含膠原蛋白的纖維化瘢痕組織快速修復(fù)受損心肌。但瘢痕組織不僅會(huì)降低心肌的收縮能力，還無法傳導(dǎo)電流，最終會(huì)誘發(fā)心律失常和心力衰竭。目前可通過使用β受體阻滯劑、腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑等藥物，通過激活抗炎通路和減少細(xì)胞凋亡來逆轉(zhuǎn)心室重塑，不能完全解決心肌細(xì)胞丟失和收縮面積減少等根本性問題。此外，還可采用心臟移植手術(shù)治療，但器官捐贈(zèng)者的短缺和免疫排斥限制了其應(yīng)用，亟待再生醫(yī)學(xué)和心臟組織工程學(xué)的重大突破。未來利用導(dǎo)電CNMs開發(fā)出與心臟生物結(jié)構(gòu)非常相似的導(dǎo)電結(jié)構(gòu)，通過實(shí)驗(yàn)室培育心臟有可能成為CVD治療的新方向和新途徑。