許驍 李澤衍 周雨揚 聶鸝慶 江洪

(武漢大學人民醫(yī)院心內科 武漢大學心臟自主神經(jīng)研究中心 武漢大學心血管病研究所 心血管病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060)

中國的心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)發(fā)病率正逐年升高，2016年中國有近400萬人死于CVD[1]。根據(jù)全球疾病負擔研究[2]，高血壓、高血脂、吸煙、高體重指數(shù)和高空腹血糖等CVD傳統(tǒng)危險因素每年可導致50萬～200萬人死于CVD。除了傳統(tǒng)危險因素，負面情緒狀態(tài)在CVD的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用[3]。已有大量研究[4]表明，抑郁、焦慮等負面情緒可通過影響自主神經(jīng)系統(tǒng)、誘發(fā)炎癥反應和改變血管內皮功能等途徑增加心肌梗死(myocardial infarction，MI)的發(fā)生風險。

下丘腦腹內側核(ventromedial hypothalamic nucleus，VMH)是下丘腦的亞核，也是大腦中調控能量代謝和情緒的關鍵腦區(qū)[5-6]。有研究[6-7]表明，VMH與抑郁、焦慮和驚恐等情緒的產生相關。另有文獻表明，VMH可調控自主神經(jīng)系統(tǒng)，激活VMH可增加交感神經(jīng)活性[8-10]，而交感神經(jīng)過度激活可誘發(fā)室性心律失常及心源性猝死[11]。然而，鮮有文獻記載VMH活性與心律失常間的直接關系。

本研究旨在探討化學遺傳激活VMH后對大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心臟電活動的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

15只雄性健康Sprague-Dawley大鼠(220～250 g)均由武漢大學動物實驗中心提供。所有動物都飼養(yǎng)在12 h光照-黑暗循環(huán)下溫度可控的環(huán)境中[溫度(24±2)℃]。對所有動物進行7 d的適應性飼養(yǎng)后，完全隨機分為對照組、MI組和激活組，每組5只。所有實驗步驟均經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院動物福利倫理委員會批準。

1.2 VMH化學遺傳激活

MI組和激活組大鼠在禁食12 h后以40 mg/kg體重經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉。大鼠麻醉后俯臥位固定于大鼠立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)，在頭皮上沿正中線開口充分暴露顱骨。參考Paxinos & Watson大鼠腦圖譜，以前囟為坐標原點定位大鼠VMH(前后：前囟后2.85 mm；旁開：中縫外側0.6 mm；深度：顱骨表面以下9.0 mm)。使用10 μL Hamilton注射器，以20 nL/min的速度將100 nL腺相關激活病毒[rAAV-hSyn-hM3d(Gq)-EGFP-WPRE-pA2/2，武漢樞密腦科學技術有限公司]注射至激活組大鼠雙側VMH。MI組以相同速度、體積注射腺相關空載病毒(rAAV-hSyn-EGFP-WPRE-pA2/2，武漢樞密腦科學技術有限公司)。注射完成后，注射器在原位置停留5 min，然后緩慢拔出。病毒注射3周后，所有大鼠均接受3.3 mg/kg體重濃度氯氮平-N-氧化物(clozapine-N-oxide ，CNO)(武漢樞密腦科學技術有限公司)腹腔注射，持續(xù)2周。

1.3 AMI模型建立

MI組和激活組大鼠在CNO腹腔注射2周后，建立AMI模型。予術前禁食12 h，以40 mg/kg濃度腹腔注射2%戊巴比妥鈉實施麻醉。以仰臥位固定于實驗臺上，連接至小動物呼吸機予以正壓通氣。經(jīng)左前胸暴露心臟，結扎左冠狀動脈造成MI。觀察大鼠心電圖ST段變化及心肌組織顏色變化。心電圖出現(xiàn)ST段抬高及心肌組織由紅色變?yōu)榘咨暈樵炷３晒Αφ战M大鼠經(jīng)左前胸暴露心臟后關閉胸腔，不結扎冠狀動脈。

1.4 體表心電圖記錄

MI造模后1 d，對大鼠進行體表心電圖測量。40 mg/kg體重腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉。頸部和胸前區(qū)備皮消毒，仰臥位固定于操作臺，行氣管插管術并連接呼吸機正壓通氣，大鼠四肢用針刺電極連接Powerlab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄心電圖，利用Labchart 8.0分析PR間期、QRS波群時限和QT間期以及心率變異性頻域指標[低頻功率(low frequency，LF)、高頻功率(high frequency，HF)及LF/HF比值]。

1.5 有效不應期

經(jīng)左前胸暴露心臟，在以下心外膜部位測量心室有效不應期(effective refractory period，ERP)：左心室心尖部(left ventricular apex，LVA)、左心室心底部(left ventricular base，LVB)和左心室心中部(the median area of left ventricle，LVM)。用Powerlab可編程多通道刺激器對上述部位進行程序電刺激。程序電刺激由8個連續(xù)周長為100 ms的S1S1刺激外加1個S2刺激組成，S1S2間期從100 ms開始，以10 ms遞減，接近ERP時以2 ms遞減，直至達到ERP。ERP定義為不能奪獲心室的最長S1S2間期。

1.6 免疫熒光

取材，將腦組織快速取下，浸泡在多聚甲醛中固定。脫水后使用冰凍切片機取VMH腦區(qū)5 μm冠狀面冰凍切片，冰凍切片37 ℃烘箱烘烤10 min，控干水分。置于4%多聚甲醛固定30 min，于磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。再將組織切片置于盛滿乙二胺四乙酸抗原修復緩沖液的修復盒中于微波爐內進行抗原修復。自然冷卻后將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈，甩干PBS，滴加牛血清白蛋白，封閉30 min后甩掉封閉液，在切片上滴加c-fos一抗(GB11069，武漢賽維爾生物科技有限公司)，切片平放于濕盒內4 ℃孵育過夜。而后將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內滴加熒光二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。再將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液，避光室溫孵育10 min。再將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。在圈內加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。最后在顯微鏡下觀察熒光表達情況。

1.7 統(tǒng)計學方法

本實驗所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示。采用GraphPad 9.0進行統(tǒng)計學分析與作圖。先對所有計量數(shù)據(jù)進行Kolmogorov-Smirnov檢驗以明確是否符合正態(tài)分布。兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗分析。將P<0.05定義為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 化學遺傳激活VMH

MI組和激活組大鼠經(jīng)化學遺傳病毒及CNO注射后，VMH腦區(qū)可見攜帶綠色熒光蛋白的病毒表達(圖1)。對三組大鼠VMH神經(jīng)元活性進行比較，發(fā)現(xiàn)MI組和激活組VMH c-fos表達量均顯著高于對照組，且激活組VMH 神經(jīng)元活性顯著高于MI組(c-fos標準化計數(shù)，激活組vs MI組：25.39±5.16 vs 18.76±3.52，P<0.05)(圖2A和圖2B)，結果提示VMH被化學遺傳激活，且激活組VMH神經(jīng)元活性顯著升高。

注:左圖為100 μm視野下轉染化學遺傳病毒rAAV-hSyn-hM3d(Gq)-EGFP-WPRE-pA2/2后局部腦區(qū)增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)熒光圖,白色橢圓虛線為VMH;右圖為20 μm視野下轉染化學遺傳病毒rAAV-hSyn-hM3d(Gq)-EGFP-WPRE-pA2/2后局部腦區(qū)EGFP熒光圖,白色箭頭所指為轉染化學遺傳病毒后表達EGFP的神經(jīng)細胞。圖1 VMH中化學遺傳病毒表達情況

注:A為50 μm視野下各組VMH c-fos表達情況。Merge為熒光圖疊加(c-fos+DAPI)。B為各組VMH中c-fos陽性細胞標準化計數(shù)。與對照組相比,##表示P<0.01;與MI組相比,*表示P<0.05。圖2 VMH中神經(jīng)元激活情況

2.2 VMH激活改變大鼠心率變異性

對三組大鼠體表心電圖進行測量，分析心率變異性。與對照組相比，MI組與激活組LF升高，HF降低，LF/HF比值升高；與MI組相比，激活組LF升高，HF降低，LF/HF比值升高。上述結果均有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)(表1)。對三組大鼠心電圖指標進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，MI組PR間期、QRS波群時限升高，但結果無顯著性差異；MI組QT間期顯著延長(P<0.01)。與MI組相比，激活組PR間期、QRS波群時限和QT間期均顯著升高(P<0.05)(表2)。

表1 三組大鼠心率變異性比較

表2 兩組大鼠心電圖指標比較 單位：ms

2.3 VMH激活降低心室ERP

通過在體電生理實驗技術測量三組大鼠LVA、LVM、LVB的ERP。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MI組和激活組左心室三個部位ERP均顯著降低，且激活組ERP顯著低于MI組(P<0.05)(表3)。

表3 三組大鼠ERP比較 單位：ms

3 討論

焦慮、憤怒和抑郁等負面情緒與CVD的發(fā)生發(fā)展密切相關[4]。有研究[12]表明，抑郁癥會增加MI、心房顫動和心源性猝死的發(fā)生率。而Roest等[13]的meta分析納入249 846例冠心病患者，結果發(fā)現(xiàn)焦慮與冠狀動脈疾病以及心源性猝死風險增加有關。

情緒相關核團及腦區(qū)在調節(jié)外周各器官生理活動中起到重要作用。在大腦中，情緒相關核團或腦區(qū)包括額葉皮層、下丘腦和杏仁核等，而這些核團可對心血管系統(tǒng)起調節(jié)作用[14]。Ruiz Vargas等[15]的meta分析顯示，利用神經(jīng)影像學技術可有效分析神經(jīng)核團的活性，而前額葉皮層的活性與心率、心率變異性正相關。而Chen等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，抑制下丘腦室旁核中活化的星形膠質細胞可減少AMI大鼠室性心律失常的發(fā)生，改善心室電活動紊亂。

VMH是下丘腦的亞核，參與各種體內穩(wěn)態(tài)調節(jié)，例如負面情緒、骨骼穩(wěn)態(tài)、糖代謝和能量代謝[17-18]，此外，VMH也是調節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)的關鍵腦區(qū)，激活VMH可增加交感神經(jīng)活性[8-10]，而交感神經(jīng)的過度激活與心律失常的發(fā)生發(fā)展密切相關[19]。早期研究表明，交感神經(jīng)激活引起心電圖復極化改變和顫動閾值降低，促進心室顫動的發(fā)生[20]，而這些效應在心肌缺血的狀態(tài)下被放大[21]。James等[22]的影像學研究顯示，VMH活性升高與血壓、心率上升具有顯著相關性，但目前并無VMH激活誘發(fā)惡性心律失常的證據(jù)。

為了特異性激活VMH，本研究采用化學遺傳技術，激活VMH神經(jīng)元上通過腺相關病毒轉染的激活型受體hM3Dq，實現(xiàn)精確調控。Coutinho等[23]曾通過該方法特異性激活VMH，發(fā)現(xiàn)VMH激活可增加外周胰島素敏感性。而Dyavanapalli等[24]也通過化學遺傳特異性激活心內膽堿能神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)心功能障礙得到改善。本實驗中，通過化學遺傳特異性激活VMH。免疫熒光結果顯示，激活組VMH腦區(qū)中c-fos表達水平較對照組顯著上升，提示VMH神經(jīng)元被成功激活。

在本研究中，通過在體心電圖檢查發(fā)現(xiàn)，激活VMH后，AMI大鼠LF顯著升高，HF降低，LF/HF升高。LF主要反映交感神經(jīng)功能，而HF主要反映迷走神經(jīng)功能[25]。已有研究[26]表明，交感神經(jīng)過度激活可引起心肌缺血后電生理紊亂，從而促進惡性心律失常的發(fā)生。此外，與對照組相比，激活組PR間期、QRS波群時限和QT間期均顯著延長。PR間期是反映房室傳導的重要指標。大型隊列研究結果表明，PR間期延長與房性及室性心律失常、心力衰竭和死亡風險增加有關[27]。PR間期延長是心房電重構和結構重構的標志，也是心臟自主神經(jīng)功能紊亂的標志[27-29]。QT間期反映房室結至心室的電傳導速度，是心室電活動的評價指標。QT間期與自主神經(jīng)功能聯(lián)系緊密。研究[30]顯示，在交感神經(jīng)張力升高或副交感神經(jīng)張力降低的情況下，QT間期延長，而QT間期延長與心肌缺血、惡性室性心律失常密切相關。根據(jù)上述研究結果可推測，VMH激活可導致交感神經(jīng)過度激活，從而引起PR間期、QT間期延長，引起心臟電活動紊亂，而激活組ERP的縮短進一步驗證了VMH激活對心臟電活動的影響。

雖然VMH活性與惡性心律失常的關系以及內在機制尚不明確，但本研究結果初步提示，VMH激活可能通過交感神經(jīng)引起心臟電活動紊亂。這為MI、心律失?；颊叩那榫w管理重要性提供了一定的依據(jù)，也為CVD患者特別是合并不良情緒的患者提供了治療方向。未來需進一步研究VMH激活誘發(fā)惡性心律失常的具體神經(jīng)通路及分子機制。