肖軼 余國龍

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008)

血管新生是指從血管床形成新的毛細(xì)血管的過程，是治療缺血性疾病的關(guān)鍵[1]。目前缺血性疾病的治療主要包括溶栓藥物和手術(shù)，但這些方法不能重塑缺血區(qū)血管床和誘導(dǎo)血管新生。近年來，研究者們利用干細(xì)胞來誘導(dǎo)缺血性疾病的血管新生[2-3]。干細(xì)胞可通過分化成細(xì)胞和/或釋放旁分泌因子來參與修復(fù)缺血區(qū)。然而，干細(xì)胞治療仍有限制性，如倫理問題、技術(shù)問題、免疫原性和致癌性等[4]。越來越多的研究表明，來自干細(xì)胞的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)能促進(jìn)缺血性疾病的治療。其中，外泌體也屬于EVs，通過轉(zhuǎn)運(yùn)各種血管生成因子到缺血組織來促進(jìn)血管新生。血管新生可能通過兩種機(jī)制發(fā)生，包括萌芽性血管新生和套入式血管新生。缺氧是誘發(fā)萌芽性血管新生的主要因素，而血流動(dòng)力學(xué)改變則可誘發(fā)套入式血管新生。萌芽性血管新生是常見的血管新生方式，主要有兩種細(xì)胞參與，包括內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁細(xì)胞(如平滑肌細(xì)胞或周細(xì)胞)[5-6](圖1)。在血管新生過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶首先降解細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)激活內(nèi)皮細(xì)胞，這個(gè)過程通常被稱為VEGF的刺激。在尖端細(xì)胞形成過程中，內(nèi)皮細(xì)胞可能變成獨(dú)特的形態(tài)，并伴有向細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)展的趨勢(shì)。柄細(xì)胞是尖端細(xì)胞后的一種細(xì)胞，支持新生管的增殖和伸長。不同的刺激因子和信號(hào)分子可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而使細(xì)胞形成發(fā)芽的小管。尖端細(xì)胞有助于新形成的管狀物的伸長和引導(dǎo)。在管狀物形成的過程中，新形成的小管相互融合，壁細(xì)胞如周細(xì)胞可促進(jìn)新生毛細(xì)血管的穩(wěn)定[5-8]。血管新生是否發(fā)生取決于促進(jìn)和抑制血管生成的因素之間的平衡關(guān)系。增加促血管生成因子(如血管生成素、成纖維細(xì)胞生長因子、VEGF、轉(zhuǎn)化生長因子-α和表皮生長因子)可誘導(dǎo)血管新生，但增加抗血管生成因子(如血管抑素、血栓軟骨素-1/2、干擾素、內(nèi)酯和膠原Ⅳ)可抑制血管生成[5-8]。

圖1 萌芽性血管新生示意圖

外泌體直徑大小30～150 nm，在電鏡下呈雙層膜的茶杯狀[9]。國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)提出了“細(xì)胞外囊泡”這個(gè)術(shù)語，指的是從生物液和細(xì)胞條件培養(yǎng)基中分離出來的囊泡。EVs包括外泌體、微囊泡和凋亡小體(圖2)。這些囊泡內(nèi)含有多類型的生物分子，它們?cè)诩?xì)胞之間轉(zhuǎn)移從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[10]。許多細(xì)胞包括正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞都可產(chǎn)生外泌體[11](圖2)。外泌體是當(dāng)不同的分子或復(fù)合物作用于多囊泡體上的內(nèi)體分揀轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物，多囊泡體與質(zhì)膜融合后產(chǎn)生的一類EVs。若在細(xì)胞內(nèi)與溶酶體融合，則發(fā)生降解，與質(zhì)膜融合后，以微囊泡形式排出細(xì)胞外。Rab GTP酶參與調(diào)節(jié)多囊泡體的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。外泌體的內(nèi)容物是由不同類型的分子組成，可能來源于高爾基體、細(xì)胞質(zhì)或內(nèi)體途徑[11]。外泌體膜上有典型的標(biāo)記物，如TSG101、Alix、整聯(lián)蛋白和四肽類(如CD63、CD9和CD81)[11]。研究[12]表明，相比于干細(xì)胞，外泌體不僅能發(fā)揮治療作用，還能避免許多風(fēng)險(xiǎn)。在此，歸納總結(jié)來自不同干細(xì)胞的外泌體在缺血性心臟病中的促血管新生作用及機(jī)制。

注：ESCRT為內(nèi)體分揀轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物。圖2 EVs的生物生成及其特點(diǎn)

1 不同干細(xì)胞來源的外泌體在缺血性心臟病中的血管新生作用

缺血性心臟病，是指各種因素引起的心臟氧供不足，心肌組織壞死和心功能異常。最常見的原因是冠狀動(dòng)脈的嚴(yán)重阻塞，臨床治療主要包括介入支架或外科搭橋。然而，這種方法適用于動(dòng)脈直徑>2 mm的患者，因此，動(dòng)脈直徑<2 mm的患者，以及有手術(shù)史、動(dòng)靜脈移植不足和冠狀動(dòng)脈病變等病史的患者仍需關(guān)注其他促血管新生的方法[13]。最新研究進(jìn)展表明，干細(xì)胞來源的外泌體能促進(jìn)缺血區(qū)血管新生，可能是一種治療心肌缺血更有前途的方法(表1)。

表1 改善缺血性心臟病血管新生的干細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)容物

1.1 心臟肌球衍生細(xì)胞來源的外泌體

心臟肌球衍生細(xì)胞(cardiosphere-derived cells，CDCs)被認(rèn)為是心臟祖細(xì)胞，能形成各種心臟細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[14]。研究表明，CDCs可誘導(dǎo)血管新生，改善心肌梗死動(dòng)物模型的心功能[15]。后續(xù)發(fā)現(xiàn)，CDCs來源的外泌體(CDCs-Exo)也有相同的作用[16]。Gallet等[17]發(fā)現(xiàn)，在急性心肌梗死(actute myocardial infarction，AMI)豬模型中，心肌內(nèi)注射CDCs-Exo可誘導(dǎo)缺血區(qū)血管新生，從而促進(jìn)心肌修復(fù)。含有miR-146a的CDCs-Exo可減少心肌細(xì)胞的凋亡并增加心肌細(xì)胞的增殖。將這些外泌體注射到小鼠AMI模型的心臟組織中，顯著促進(jìn)了血管新生和心肌修復(fù)。Namazi等[18]發(fā)現(xiàn)，缺氧狀態(tài)下的CDCs可釋放出內(nèi)含不同miRNAs的外泌體，這些外泌體含有高水平的miR-210、miR-130a和miR-126，能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的血管新生。

1.2 心肌祖細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞來源的外泌體

心肌祖細(xì)胞(cardiac progenitor cells，CPCs)和內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)可分別形成心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。研究表明，缺氧微環(huán)境下的CPCs及其外泌體(CPCs-Exo)可促進(jìn)血管新生和心肌修復(fù)[19]。CPCs-Exo內(nèi)含豐富的miR-210，具有抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成和改善心功能等保護(hù)作用[20]。過表達(dá)miR-322的CPCs-Exo可促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生，其機(jī)制是通過增加活性氧來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和毛細(xì)血管形成[21]。另外，研究[22]表明過表達(dá)骨鈣素(osteocalcin，OCN)的EPCs來源的外泌體可通過激活OCN-GPRC6A通路來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生。

1.3 胚胎干細(xì)胞來源的外泌體

Khan等[23]將胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)來源的外泌體注射到小鼠AMI模型的心肌組織內(nèi)，結(jié)果表明心肌中新生血管密度明顯增加。來自人ESCs衍生的CPCs-Exo移植到小鼠AMI模型有心臟保護(hù)作用。進(jìn)一步研究[24]表明，外泌體移植的心肌中有927個(gè)基因上調(diào)，其中大部分與心臟功能有關(guān)。同樣，在小鼠缺血再灌注損傷模型中，從人ESCs衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源的外泌體通過促進(jìn)磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶(p-Akt)和磷酸化糖原合酶激酶3β(p-GSK-3β)的表達(dá)可減少梗死面積，促進(jìn)血管新生和心肌修復(fù)[25]。

1.4 CD34+細(xì)胞來源的外泌體

研究[26]表明，CD34+細(xì)胞來源的外泌體(CD34+-Exo)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活和增殖，有利于血管新生。Mackie等[27]發(fā)現(xiàn)，CD34+-Exo內(nèi)含高水平的Sonic Hedgehog(Shh)蛋白，可改善心肌梗死缺血區(qū)血管新生和心功能。

1.5 MSCs來源的外泌體

MSCs來源的外泌體(MSCs-Exo)可被內(nèi)皮細(xì)胞攝取，從而促進(jìn)血管新生。Teng等[28]發(fā)現(xiàn)在心肌梗死動(dòng)物模型中注射MSCs-Exo可增加新生血管密度。研究[29]表明，過表達(dá)CXCR4的MSCs-Exo可激活心肌細(xì)胞內(nèi)Akt信號(hào)通路，從而抑制心肌細(xì)胞的凋亡，并增加VEGF的表達(dá)和血管新生。在大鼠心肌梗死模型中，這些外泌體通過誘導(dǎo)血管新生、減少梗死面積和增加心臟功能來促進(jìn)心肌梗死后的恢復(fù)[29]。Vrijsen等[30]通過體外和體內(nèi)試驗(yàn)表明，骨髓MSCs-Exo可通過激活ERK/Akt信號(hào)通路來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和新生血管的形成。另有研究[31]表明，臍帶MSCs-Exo能上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，從而增加內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和新生血管的形成。Wang等[32]研究認(rèn)為，在大鼠AMI模型上，與骨髓和脂肪來源的MSCs-Exo相比，子宮內(nèi)膜來源的MSCs-Exo能更有效地增加新生微血管密度。這些外泌體中含有豐富的miR-21，可通過激活PTEN/Akt通路發(fā)揮心臟保護(hù)作用。另外，研究[33]發(fā)現(xiàn)MSCs-Exo可轉(zhuǎn)運(yùn)miR-30b到HUVECs，靶向調(diào)節(jié)DLL4，從而發(fā)揮血管新生作用。最新研究[34]發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，骨髓MSCs-Exo可通過轉(zhuǎn)移高遷移率族蛋白B1到HUVECs，通過JNK/HIF-1α途徑促進(jìn)血管新生。

1.6 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的外泌體

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)在組織再生領(lǐng)域具有重要作用。iPSCs是通過將體細(xì)胞重新編碼為類似胚胎的多能狀態(tài)而產(chǎn)生的，具有不同的分化特征。iPSCs和其外泌體(iPSCs-Exo)通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管新生，在心力衰竭的治療中具有積極的作用。例如，當(dāng)iPSC-Exo被注入心肌梗死小鼠的心臟時(shí)，其增加了梗死區(qū)和邊界區(qū)毛細(xì)血管的再生[35]。iPSCs衍生的CPCs-Exo能促進(jìn)HUVECs遷移和血管新生。此外，這些外泌體的治療能顯著提高左室射血分?jǐn)?shù)和減少左室容積，有助于恢復(fù)心功能[36]。

2 優(yōu)勢(shì)和限制

外泌體在缺血性心臟病的應(yīng)用中具備很多優(yōu)勢(shì)。研究者們[37]可通過不同的方式，如細(xì)胞工程或預(yù)處理母體細(xì)胞，改變外泌體內(nèi)容物，將特定的生物分子傳遞到靶細(xì)胞。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是外泌體本身的生物特質(zhì)，可使其成為生物成分和藥物的天然納米載體。因此，外泌體未來有望應(yīng)用于個(gè)性化醫(yī)療。此外，外泌體的移植，尤其是MSCs-Exo，是相對(duì)安全和非腫瘤源性的，甚至異體來源也不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥。盡管如此，目前在外泌體的定義、分離和應(yīng)用方面仍有一些限制。一些研究可能未使用國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)更新的外泌體指南。EVs的大小甚至標(biāo)記都可能重疊，這可能會(huì)影響結(jié)果，所以研究者可能會(huì)無意中使用外泌體這個(gè)術(shù)語。另外，當(dāng)研究者使用不同的方法來分離外泌體也會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。此外，不同的外泌體給藥方式對(duì)于治療效果至關(guān)重要。盡管研究者已研究了不同的給藥方法來將外泌體送入靶組織，但究竟哪一種給藥方式獲益更多仍需更多的研究數(shù)據(jù)來支持[4]。

3 總結(jié)

大量研究表明干細(xì)胞來源的外泌體具有促血管新生的潛力，可參與治療缺血性心臟病，但這些研究大多是在臨床前進(jìn)行的，臨床研究仍有待繼續(xù)推進(jìn)。外泌體治療雖然有優(yōu)勢(shì)，但也有一些局限，未來需更多研究來解決，包括分離方式、給藥方法及保存條件等，最終使得外泌體治療能應(yīng)用于臨床。