明 亮，楊慎友，黃 埔

(1 鄒平市人民醫(yī)院，山東 鄒平 256200；2 金鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院，山東 金鄉(xiāng) 272200；3山東國欣頤養(yǎng)集團(tuán)棗莊醫(yī)院，山東 棗莊 277100)

阻塞性睡眠呼吸暫停(Obstructive sleep apnea，OSA)是以睡眠時(shí)上氣道反復(fù)塌陷為特點(diǎn)，并伴隨血氧下降和睡眠結(jié)構(gòu)紊亂的睡眠呼吸障礙性疾病，是心血管疾病獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，患者通常伴有全身或肺動脈高壓、糖尿病或肥胖。其發(fā)病機(jī)制包括交感神經(jīng)激活、內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥[1-2]。而OSA誘發(fā)心血管疾病的具體病理生理學(xué)和確切的潛在機(jī)制還有待闡明。

最近的研究表明，長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNAs)以表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的形式調(diào)控基因表達(dá)，并在X染色體沉默、基因組印記和染色質(zhì)修飾中發(fā)揮作用[3]。lncRNAs與癌癥的密切關(guān)系正逐步得到證實(shí)，但其在OSA誘發(fā)心血管疾病的過程中是否發(fā)揮作用有待研究。本研究對慢性間歇性缺氧(Chronic intermittent hypoxia，CIH)鼠模型的心臟組織通過Illumina測序平臺進(jìn)行了lncRNAs和mRNAs表達(dá)譜分析，為進(jìn)一步研究lncRNAs在OSA誘導(dǎo)的心血管疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1研究對象 雄性8周齡C57BL/6J小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，共20只，平均體重(20.18±0.70)g，普通飼料常氧條件下飼養(yǎng)1周后將其隨機(jī)分為CIH組和對照組，各10只。

1.2方法 CIH組小鼠模型的制備見參考文獻(xiàn)[4]。小鼠心臟組織RNA的提?。簝山M小鼠分別培養(yǎng)3個(gè)月后各取3只處死，將其新鮮心臟組織用trizol試劑提取總RNA以便測序。RNA的測序及分析：兩組小鼠心臟組織的lncRNAs和mRNAs表達(dá)譜的檢測由北京安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司采用Illumina測序平臺完成，數(shù)據(jù)分析由北京中康博生物科技有限公司輔助完成。

1.3數(shù)據(jù)處理 用R(3.5.1)以及R studio軟件及可視化R包-ggplot2(3.1.0)對不同樣本、實(shí)驗(yàn)條件中差異表達(dá)的RNA進(jìn)行層次聚類分析，包括聚類熱圖、散點(diǎn)圖和火山圖。采用GO/KEGG進(jìn)行富集分析。lncRNAs及mRNAs篩選的標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)變化值≥1.2且P≤0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組lncRNAs和mRNAs表達(dá)量的分析 分層聚類分析結(jié)果見封三圖1A、B；濃度分布趨勢散點(diǎn)圖見封三圖1C、D；兩組lncRNAs及mRNA基因表達(dá)差異結(jié)果的數(shù)據(jù)分布見封三圖1E、F。比較發(fā)現(xiàn)66條lncRNAs和1606條mRNAs在CIH小鼠心臟組織中表達(dá)有差異。66條lncRNAs中上調(diào)的有13條，下調(diào)的有53條；1606條mRNAs中，上調(diào)的有476條，下調(diào)的有1130條。見封三圖2。

2.2CIH小鼠mRNAs的生物信息學(xué)分析 GO分析：增強(qiáng)的功能有100個(gè)，重要的增強(qiáng)功能是活性氧代謝過程、NF-κB的細(xì)胞質(zhì)隔離、白細(xì)胞介素-1β分泌、巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控；減弱的功能有225個(gè)，包括免疫系統(tǒng)過程、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、Wnt信號通路、平面細(xì)胞極性通路的正調(diào)控、細(xì)胞生長的負(fù)調(diào)控、平滑肌細(xì)胞遷移的負(fù)調(diào)控、凋亡過程、內(nèi)皮細(xì)胞遷移的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控等。

KEGG分析：有37條上調(diào)通路和88條下調(diào)通路。上調(diào)的通路有意義的有：氧化磷酸化、HIF-1信號通路、癌癥的中樞碳代謝、PPAR信號通路、p53信號通路；下調(diào)的通路有意義的有：癌癥的通路、趨化因子信號通路、MAPK信號通路、Jak-STAT信號通路、IL-17信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、甲狀腺癌、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等。分類分析中，高級分類主要與生物系統(tǒng)、人類疾病、新陳代謝、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程相關(guān)，中級分類也體現(xiàn)出與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌癥、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管疾病等相關(guān)。

2.3生物學(xué)標(biāo)志物的共表達(dá)數(shù)量及差異表達(dá)情況 兩組差異表達(dá)的基因與另一基因的共表達(dá)情況如表1所示，取共表達(dá)最多的前10個(gè)差異表達(dá)基因，其中Gm13056及AC157516.1的表達(dá)上調(diào)，余基因表達(dá)均為下調(diào)。

表1 兩組生物學(xué)標(biāo)志物的共表達(dá)數(shù)量及差異表達(dá)情況

3 討論

對于OSA，理想的生物標(biāo)志物不僅與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，而且對心血管結(jié)局有很強(qiáng)的預(yù)測作用，其水平的改變將相應(yīng)地降低風(fēng)險(xiǎn)。RNA測序用于發(fā)現(xiàn)疾病患者與健康人之間差異表達(dá)的基因，針對miRNAs的測序分析相對比較成熟，然而對lncRNAs的研究較少。lncRNAs是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，起初被認(rèn)為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。后來的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs不僅參與X染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活等調(diào)控過程，而且其轉(zhuǎn)錄過程還會影響染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，作為轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子以及染色質(zhì)修飾復(fù)合物的向?qū)Оl(fā)揮著重要作用[5-6]。為了揭示lncRNAs在調(diào)節(jié)OSA功能過程中的重要作用，一些研究學(xué)者描述了lncRNAs在慢性間歇性缺氧中的表達(dá)[6]。

本文對lncRNA在CIH小鼠中的表達(dá)及可能的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)13條lncRNAs和476條mRNAs表達(dá)上調(diào)，53條lncRNAs和1130條 mRNAs表達(dá)下調(diào)。對有差異性表達(dá)的上下調(diào)的mRNAs進(jìn)行了GO分析發(fā)現(xiàn)：功能增強(qiáng)的有100個(gè)，重要的增強(qiáng)功能是活性氧代謝過程、NF-κB的細(xì)胞質(zhì)隔離、白細(xì)胞介素-1β分泌、巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控；減弱的功能有225個(gè)，包括免疫系統(tǒng)過程、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、Wnt信號通路、平面細(xì)胞極性通路的正調(diào)控、細(xì)胞生長的負(fù)調(diào)控、平滑肌細(xì)胞遷移的負(fù)調(diào)控、凋亡過程、內(nèi)皮細(xì)胞遷移的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控等。增強(qiáng)的功能主要和炎癥相關(guān)，減弱的功能主要和細(xì)胞增殖、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)。KEGG分析發(fā)現(xiàn)：上調(diào)的有37個(gè)，下調(diào)的有88個(gè)；高級分類含有的顯著性Pathway數(shù)目較多的包括“人類疾病”有關(guān)；中級分類含有心血管疾病，這也和OSA與心腦血管發(fā)病率的增加有關(guān)相吻合。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了CIH誘導(dǎo)的OSA鼠模型的差異表達(dá)基因，為研究lncRNAs在OSA誘導(dǎo)的心血管疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。