亞庫甫·托合提，張凱楠，趙輝，吾布里塔里甫·達吾提，張蕊，林仁勇，呂國棟，

本研究價值：

（1）甲胎蛋白（AFP）廣泛應(yīng)用于肝細胞癌（HCC）的診斷，但約40%的肝癌患者AFP水平并不升高，針對這部分人群的癌癥篩查工作進行深入研究具有極重要的實際應(yīng)用價值。（2）本研究發(fā)現(xiàn)血清毒蕈堿乙酰膽堿受體m3自身抗體（m3AchR-Ab）對 AFP陰性HCC具有較高的診斷效能，m3AchR-Ab與AFP進行聯(lián)合診斷可以提高HCC診斷效能。（3）m3AchR-Ab與HCC嚴重程度相關(guān)，可能在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，但是其具體作用機制尚不清楚，值得進一步研究。

本研究局限性：

本研究的樣本量較小，代表性稍差；本研究只探究了m3AchR-Ab在HCC中的表達水平，暫未評估其在其他腫瘤疾病中的表達情況。

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤之一［1］，死亡率居所有癌癥第三位。在中國因HCC死亡的癌癥患者僅次于肺癌［2］。HCC病因復(fù)雜，早期診斷難度大［3］。目前，甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）已廣泛應(yīng)用于HCC的診斷［4-5］，但其靈敏度僅為41%～65%［6］。在臨床上AFP診斷HCC的截斷值為20 ng/mL，血清AFP水平＜ 20 ng/ml的HCC被稱為AFP陰性HCC［7-8］。AFP陰性HCC患者在早期篩查中容易被漏診，因此亟須尋找新型生物標志物用于診斷AFP陰性的疑似HCC患者。毒蕈堿乙酰膽堿受體m3自身抗體（muscarinic acetylcholine receptor m3 autoantibody，m3AchR-Ab）是原發(fā)性干燥綜合征［9］、原發(fā)性膽汁性肝硬化［10］等疾病的候選生物標志物。然而，有關(guān)其對AFP陰性HCC診斷價值的研究報道較少。本研究通過測量血清m3AchR-Ab水平，探討其對AFP陰性HCC患者的診斷價值，旨在為AFP陰性HCC患者的臨床診斷提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院標本庫于2011年11月至2015年9月入庫的257例患者血清樣本，其中90例為HCC患者（HCC組），89例為良性肝病（如肝硬化及肝血管瘤）患者（良性肝病組），78例為健康受試者（對照組）。納入標準：（1）HCC組患者均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診，且符合《原發(fā)性肝癌病理診斷實踐指南（2015年版）》［11］；（2）良性肝病組患者均經(jīng)臨床、免疫學(xué)、影像學(xué)及血清學(xué)檢查確診；（3）病歷資料完整；（4）參與本研究前未行手術(shù)、放化療等治療。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）合并免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病。受試者均簽署知情同意書，本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：k201906-06）。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 收集HCC患者一般資料，包括性別、年齡、腫瘤大?。ㄗ畲笾睆剑┖蛿?shù)量、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、乙肝表面抗原（HBsAg）等；收集良性肝病患者和健康受試者的性別、年齡等資料。

1.2.2 血清AFP及m3AchR-Ab水平檢測 血清AFP水平的檢測采用雅培自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（Abbott公司生產(chǎn)，型號：Abbott i2000SR）及配套試劑盒（Abbott公司生產(chǎn)，批號：Abbott 3P36/07P90），檢測步驟嚴格按照配套試劑盒說明書進行；血清m3AchRAb水平的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linkedimmunosorbent serologic assay，ELISA），檢測步驟嚴格按照m3AchR-Ab試劑盒（上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn)，貨號：JL12216，生產(chǎn)批號：Mar 2021）說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。不符合正態(tài)分布的計量資料以 M（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清m3AchR-Ab水平對AFP陰性HCC患者的診斷價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組、良性肝病組、HCC組和對照組血清m3AchR-Ab水平比較 三組血清m3AchR-Ab水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（H=126.30，P＜0.01）。HCC組血清m3AchR-Ab水平高于良性肝病組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；良性肝病組血清m3AchRAb水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 對照組、HCC組、良性肝病組血清m3AchR-Ab水平〔M（P25，P75），ng/ml〕Table 1 Levels of serum m3AchR-Ab among hepatocellular carcinoma patients，benign liver disease patients and healthy controls

2.2 HCC患者臨床特征與血清m3AchR-Ab水平的關(guān)系血清m3AchR-Ab水平在不同腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HBsAg表達情況的HCC患者中比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；血清m3AchR-Ab水平在不同性別、年齡、腫瘤數(shù)量和遠處轉(zhuǎn)移的HCC患者中比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 HCC患者臨床特征與血清m3AchR-Ab水平的關(guān)系〔n=90，M（P25，P75），ng/ml〕Table 2 Correlations of serum m3AchR-Ab level with clinicopathological characteristics in hepatocellular carcinoma

2.3 血清m3AchR-Ab、AFP水平診斷HCC的ROC曲線 血清m3AchR-Ab水平診斷HCC的ROC曲線下面積（AUC）為0.89〔95% CI（0.84，0.95）〕，最佳截斷值為74.00 ng/ml，靈敏度為88.89%，特異度為91.02%。血清AFP水平診斷HCC的AUC為0.88〔95% CI（0.82，0.93）〕，最佳截斷值為27.42 ng/ml，靈敏度為71.11%，特異度為95.81%，見圖1、表3。

2.4 血清m3AchR-Ab水平聯(lián)合血清AFP水平診斷HCC的ROC曲線 運用二元Logistic回歸分析得到血清m3AchR-Ab水平與血清AFP水平的聯(lián)合變量并進行ROC曲線分析，結(jié)果顯示，血清m3AchR-Ab水平和血清AFP水平聯(lián)合診斷HCC的AUC為0.90〔95% CI（0.85，0.95）〕，靈敏度、特異度分別為90.00%、80.02%，見圖1、表3。

圖1 血清m3AchR-Ab、AFP水平和二者聯(lián)合對HCC診斷價值的ROC曲線Figure 1 ROC curves of serum m3AchR-Ab，AFP，and m3AchR-Ab plus AFP in diagnosing hepatocellular carcinoma

表3 血清m3AchR-Ab、AFP水平及二者聯(lián)合對HCC的診斷價值Table 3 Diagnostic value of serum m3AchR-Ab，AFP and the combination of them for hepatocellular carcinoma

2.5 血清m3AchR-Ab水平診斷AFP陰性HCC的ROC曲線 經(jīng)血清AFP水平檢測，90例HCC患者中25例為AFP陰性HCC（AFP＜20 ng/ml）。ROC曲線結(jié)果顯示，血清m3AchR-Ab水平診斷AFP陰性HCC和的AUC為0.69 〔95% CI（0.54，0.83）〕，最佳截斷值為 74.00 ng/ml，靈敏度為64.00%，特異度為91.02%，見圖2。

圖2 血清m3AchR-Ab水平對AFP陰性HCC診斷價值的ROC曲線Figure 2 ROC curve of serum m3AchR-Ab in the diagnosis of AFP-negative hepatocellular carcinoma

3 討論

在針對疑似HCC患者的診療過程中，目前主要依賴血清AFP水平來進行診斷，但是LUO等［12］提出，約40%的HCC患者血清AFP水平并未升高，所以針對AFP陰性的疑似HCC患者的篩查工作進行深入研究具有極重要的實際應(yīng)用價值。本研究發(fā)現(xiàn)血清m3AchRAb水平對診斷HCC具有較高的靈敏度和特異度。相關(guān)研究顯示，m3AchR-Ab診斷HCC的靈敏度和特異度與AFP、甲胎蛋白異質(zhì)體（alpha fetoprotein-L3，AFP-L3）、異常凝血酶原（protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ）等相當［13］。本研究還發(fā)現(xiàn)，通過聯(lián)合m3AchR-Ab與AFP可以將HCC的診斷靈敏度提高至90.00%。但本研究目前只檢測了m3AchR-Ab在HCC的表達水平，其是否在其他腫瘤中持續(xù)高表達仍然未知，需進一步研究并評估其特異性。

吳孟超院士團隊提出磷脂酰肌醇蛋白多糖3（glypican-3，GPC3）可以作為AFP陰性的HCC患者的有效篩查指標，其靈敏度為76.70%［14-16］。本研究結(jié)果顯示，m3AchR-Ab用于診斷AFP陰性HCC的靈敏度與GPC3接近，提示本指標也具有較高的診斷效能，m3AchR-Ab不僅可應(yīng)用于臨床HCC患者的篩查，還能應(yīng)用于AFP陰性的疑似HCC患者的篩查。此外，m3AchR-Ab與近年來報道的新型生物標志物，如環(huán)化酶相關(guān)蛋白 2［17］、AFP-L3［18］和 PIVKA- Ⅱ［19］等在診斷AFP陰性HCC時的靈敏度和特異度相當或較優(yōu)。因此推測m3AchR-Ab是一種AFP陰性HCC的候選生物標志物，具有一定的臨床轉(zhuǎn)化價值和應(yīng)用潛力。

本研究發(fā)現(xiàn)m3AchR-Ab在HCC患者血清中高表達，其水平與HCC患者腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HBsAg表達等臨床特征相關(guān)。既往研究認為毒蕈堿乙酰膽堿受體m3（m3AchR）參與了結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌和肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［20］，但是鮮有報道提出m3AchR與HCC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。本課題組推測m3AchR-Ab可能在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。YU等［21］研究提出，在缺乏外源性m3AchR激動劑的情況下，m3AchR-Ab可能對m3AchR產(chǎn)生激動作用，進而通過下游通路發(fā)揮生物學(xué)作用，這可能是m3AchR-Ab參與HCC進展的重要機制，但仍需更直接的證據(jù)，本課題組也會對該科學(xué)假說進行持續(xù)研究。

綜上所述，m3AchR-Ab是潛在的AFP陰性HCC的篩查指標，同時也可與AFP聯(lián)用以大幅提高診斷HCC的靈敏度，這在HCC診斷中具有重要臨床意義。

作者貢獻：亞庫甫·托合提進行研究的實施與可行性分析；亞庫甫·托合提、張凱楠進行結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文；張凱楠進行數(shù)據(jù)整理；亞庫甫·托合提、張凱楠、呂國棟進行論文的修訂；趙輝進行數(shù)據(jù)收集；吾布里塔里甫·達吾提、張蕊進行統(tǒng)計學(xué)處理；林仁勇負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；呂國棟進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。