陳偉康，黃 東，劉德鴻，劉艷梅，陳 希

（江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029）

復(fù)方夏天無(wú)片由夏天無(wú)、制草烏、人工麝香、乳香、麻黃等33 味藥制成。該藥具有祛風(fēng)逐濕，舒筋活絡(luò)，行血止痛之功效，臨床常用于風(fēng)濕淤血阻滯，經(jīng)絡(luò)不通引起的關(guān)節(jié)腫痛，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[1]。麻黃雖然在處方中藥量較小，每1000 片中含1.5g，但由于麻黃中的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿能引起患者發(fā)生血壓升高[2-4]、興奮[5]、失眠[6]、心律失常[7]等不良反應(yīng)，兩者在制劑中的含量值得關(guān)注。目前，復(fù)方夏天無(wú)片標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2020年版一部，該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)麻黃無(wú)質(zhì)量控制項(xiàng)目。因麻黃在處方中的用量較少，而處方藥味眾多，采用普通HPLC 法分析鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿，存在靈敏度不足，基質(zhì)干擾嚴(yán)重等缺點(diǎn)，而UHPLC-MS/MS 具有較高的靈敏度和選擇性[8]。因此，研究建立復(fù)方夏天無(wú)片中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，用于評(píng)價(jià)復(fù)方夏天無(wú)片中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對(duì)患者的影響，具有重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Agilent 1290 型超高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；API4000 型三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB 公司）；100～1000μL Finnpipette 移液器（美國(guó)熱電公司）；Sartorius BT 25 S 型天平（賽多利斯（北京）有限公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

鹽酸麻黃堿（批號(hào)：171241-200506）、鹽酸偽麻黃堿（批號(hào)：171237-201208），中國(guó)食品藥品鑒定研究院；復(fù)方夏天無(wú)片（市售品，規(guī)格：薄膜衣片0.32g·片-13 批）；乙腈（色譜純 美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；甲酸（色譜純 美國(guó)TE-DIA 公司）；水為Milli-Q 制備的超純水。

1.2 液質(zhì)聯(lián)用條件

液相色譜儀 采用Themo Scientific（150mm×2mm, 3μm）色譜柱，柱溫：40℃。以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相，流速：0.4mL·min-1，梯度洗脫：0～1min（乙腈）=5%，1～5min（乙腈）=5%～70%，5～7min（乙腈）=70%。進(jìn)樣量：1μL。

質(zhì)譜儀 采用電噴霧離子源（ESI），正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，離子源溫度500℃，噴霧電壓5000V，噴霧氣60psi，干燥氣55psi，氣簾氣25psi；因鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿為同分異構(gòu)體，試驗(yàn)表明，兩者母離子、子離子以及質(zhì)譜參數(shù)一致，即：母離子166.2，子離子148.3，解簇電壓23V，碰撞電壓21V。

1.3 溶液的制備

1.3.1 供試品溶液的制備 取復(fù)方夏天無(wú)片，除去薄膜衣，研細(xì)，精密稱取0.5g，置50mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL ，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液用0.22μm 的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品12.78、14.68mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，4℃冰箱避光保存。分別精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋成含鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿分別為1.278、1.4684μg·mL-1混合對(duì)照品溶液。精密吸取上述混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，配置 成 含 鹽 酸 麻 黃 堿1022.43、639.0、255.6、127.8、63.9、51.12ng·mL-1, 含鹽酸偽麻黃堿1174.4、734、293.6、146.8、73.4、58.72ng·mL-1系列混合對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定條件的選擇與優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)比較了HPLC-UV 法和UHPLC-MS/MS兩種方法測(cè)定待測(cè)物。圖1 為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖。

圖1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.1 Chromatograms of MRM

因復(fù)方夏天無(wú)片處方復(fù)雜，在210nm 末端吸收下采用HPLC-UV 法測(cè)定，靈敏度不高，且鹽酸麻黃堿在保留時(shí)間50min 出峰還和雜質(zhì)峰有所包雜；而UHPLC-MS/MS 能在7min 之內(nèi)完成分析，專屬性良好，因此，選用UHLC-MS/MS 進(jìn)行測(cè)定。

2.2 線性關(guān)系考察

精密吸取系列混合對(duì)照品溶液1μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀分析，以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，用Analyst 工作站擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果鹽酸麻黃堿在51.12～1022.43ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=4.48×103X+8.11×105，相關(guān)系數(shù)r=0.9998；鹽酸偽麻黃堿在58.72～1174.4ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=3.95×103X+1.08×106，相關(guān)系數(shù)r=0.9989。

2.3 精密度考察

取混合對(duì)照品溶液，按“2.1 色譜條件”重復(fù)測(cè)定6 次，結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD 分別為6.3%，4.9%，符合液質(zhì)聯(lián)用法儀器精密度要求。

2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取供試品粉末6 份，每份0.5g，按1.3.1條件處理成供試品溶液，按1.2 測(cè)定。結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿含量平均值為17.9、7.89μg·g-1，RSD 分別為6.0%，5.6%，重現(xiàn)性符合液質(zhì)聯(lián)用法方法學(xué)要求。

2.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取供試品粉末6 份，每份0.25g，分別精密加入鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品溶液（含鹽酸麻黃堿90.2ng·mL-1，鹽酸偽麻黃堿39.5ng·mL-1）50mL，按1.2 條件測(cè)定結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery（n=6）

2.6 樣品測(cè)定

取江西康恩貝天施康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的復(fù)方夏天無(wú)片3 批，按1.2 條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3 批樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=2）Tab.2 Results of content determination of three samples

由表2 數(shù)據(jù)可知，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿在夏天無(wú)片中的含量較低，但上述兩種生物堿生物活性較強(qiáng)，其含量波動(dòng)容易對(duì)患有高血壓基礎(chǔ)疾病的患者產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，采用UHPLCMS/MS 代替?zhèn)鹘y(tǒng)的液相色譜法，快速測(cè)定基質(zhì)復(fù)雜樣品中的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量，控制復(fù)方夏天無(wú)片中的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量具有一定的意義。

3 結(jié)論

麻黃在復(fù)方夏天無(wú)片處方中含量低，采用普通的液相色譜分析干擾大，分析時(shí)間長(zhǎng)。本項(xiàng)研究建立了超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方夏天無(wú)片中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量的方法，該方法靈敏度高，專屬性良好，分析時(shí)間短，方法學(xué)考察符合要求，可以用于復(fù)方夏天無(wú)中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的評(píng)價(jià)。