陳 娟，周娟娟，秦亞東

（1.安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院/蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院 制劑室，安徽 蕪湖 241002；2. 安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；3. 安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，安徽 蕪湖 241002）

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill. 的干燥成熟果實，主要分布在我國東北地區(qū)，又稱北五味子。南五味子為木蘭科植物華中五味子Schisandra sphenantheraRehd. et Wils. 的干燥成熟果實[1]，主要分布在我國山西、河南、安徽等地，又稱華中五味子。歷史上，南、北五味子作為不同來源的同一味藥材收載和臨床應(yīng)用。自1995 年版《中國藥典》起，南、北五味子作為兩味藥材進(jìn)行收載，兩味藥材味酸、甘、溫，歸肺、心、腎經(jīng)，均具收斂固澀、益氣生津、補腎寧心之功。南、北五味子為同科同屬植物，在外觀性狀、顯微特征方面較為相似[2-3]，為鑒別帶來了困難，加上野生北五味子價高量少，導(dǎo)致市場上時常有混用、摻入現(xiàn)象，因此，急需建立一種快速可靠的鑒別方法。

近年來，基于薄層色譜[4]、液相色譜[5-7]、紅外光譜[8]、液質(zhì)聯(lián)用[9-11]等現(xiàn)代分析技術(shù)研究顯示，以五味子醇甲、五味子酯甲等為代表的木脂素類化學(xué)成分在南、北五味子中存在著顯著差異，可以作為識別標(biāo)記物或質(zhì)量標(biāo)記物，從而達(dá)到二味藥材鑒別的目的。課題組曾報道過南、北五味子液相色譜指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)手段對比分析研究，結(jié)果也表明五味子醇甲、五味子酯甲等為代表的木脂素類化學(xué)成分是南、北五味子主要差異性成分。2020 年版《中國藥典》（一部）中明確規(guī)定了南、北五味子的定量指標(biāo)分別為五味子醇甲和五味子酯甲，現(xiàn)代分析研究結(jié)果驗證了《中國藥典》定量指標(biāo)設(shè)置的合理性。除上述方法外，基于藥材顏色、氣味、味覺、二維熒光光譜[12]和DNA 指紋圖譜[13]等技術(shù)均可成功鑒別南、北五味子，然而這些方法往往試劑消耗大、分析時間長。

直接進(jìn)樣紫外（Flow-injection ultraviolet spectroscope,FI-UV）指紋圖譜利用HPLC 技術(shù)，不經(jīng)過色譜柱分離，只經(jīng)過一根長度為5 mm 的保護(hù)柱（僅起到粗分和保護(hù)檢測器功能）。相對于HPLC 指紋圖譜，F(xiàn)I-UV 的突出優(yōu)勢是分析時間短（1 ～2 min/樣），尤其適合大批量樣品測試，目前國內(nèi)未見文獻(xiàn)報道。通過設(shè)置二極管陣列檢測器（DAD）相關(guān)參數(shù)，以總紫外吸收、紫外光譜等為數(shù)據(jù)源繪制吸收曲線，可以直觀地分析藥材質(zhì)量，達(dá)到可視化快速鑒別的目的；同時結(jié)合化學(xué)計量學(xué)手段，可以快速篩選關(guān)鍵變量[12-13]，避免主觀判別造成的誤差。FI-UV 與HPLC 指紋圖譜相比優(yōu)勢十分明顯，具有簡單、快速的顯著特點。本研究采用FI-UV 指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)識別模式快速鑒別南、北五味子，為其分類鑒別提供了一種新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；FA1204 型精密電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；JK-250DB 型超聲波清洗儀（合肥金尼克超聲波清洗機(jī)廠）；Minispin 型臺式離心機(jī)（北京宏達(dá)恒業(yè)科技有限公司）。

1.2 試藥

南、北五味子藥材采購于安徽省亳州市康美中藥材大市場及藥店，北五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.（SCB）的 干 燥 成熟果實，南五味子為木蘭科植物華中五味子Schisandra sphenantheraRehd. et Wils.（SSW）的干燥成熟果實，均經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院/蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院中藥材炮制中心祁俊主任中藥師鑒定，樣品信息見表1。藥材粉碎后，過60 目篩，密封于EP 管中，置4 ℃冰箱中存儲備用。乙腈、甲酸為色譜級（TEDIA，USA）、水為實驗室自制超純水、甲醇為分析純。

表1 樣品信息Tab. 1 Information of test sample

2 方法和結(jié)果

2.1 紫外指紋圖譜條件

2.1.1 色譜條件 安捷倫保護(hù)柱：Agilent Zorbax SBC18柱（5 mm × 2.1 mm, 1.8 μm）；流動相：乙腈-水溶液（50 ∶50 / V ∶V），等度洗脫；流速：0.15 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；檢測波長：254 nm。

2.1.2 檢測器條件 設(shè)置DAD 檢測器響應(yīng)值：20 Hz，采集頻率：0.05 s/次，掃描范圍：190 ～400 nm，步進(jìn)值：1 nm，進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 供試品處理方法

樣品粗粉過60 目篩，經(jīng)恒溫干燥至恒重后，精密稱取五味子粉末 0.100 0 g,置15 mL 具塞離心管中，加入50%甲醇-水（V ∶V）溶液10 mL，超聲1 h 后離心處理（3 000 r/min）15 min，上層溶液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 以SCB1 樣品為考察對象，按“2.2”項下方法制備供試品1 份，按“2.1”項下條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”，經(jīng)多點校正、自動匹配，結(jié)果相似度均大于0.982，說明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 以SCB1 樣品為考察對象，按“2.2”項下方法條件制備供試品6 份，按“2.1”項下條件分別于0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣，數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”，結(jié)果相似度均大于0.965，說明樣品在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗 以SCB1 樣品為考察對象，按“2.2”項下方法條件，制備供試品溶液6 份，按“2.1”項下條件分別進(jìn)樣，數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”，結(jié)果相似度均大于0.977，說明該方法重復(fù)性良好。

2.4 直接進(jìn)樣紫外指紋圖譜

2.4.1 總紫外吸收指紋圖譜 所有供試液經(jīng)液相色譜儀自動進(jìn)樣1 μL，通過C18保護(hù)柱，不經(jīng)色譜柱分離直接進(jìn)入DAD 檢測器，按“2.1”項進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，每個樣品平行進(jìn)樣 3 次。11 批 SCB 樣品和11 批 SSW 樣品的FI-UV 指紋圖譜，見圖1。直觀分析可見，SCB 和SSW 樣品的總吸收指紋圖譜輪廓明顯不同，其中，SCB 樣品（圖1A）在保留時間約0.13 min 處的吸收明顯小于SSW 樣品（圖1B）；在保留時間約0.25 min 處，SCB 樣品的吸收明顯高于SSW 樣品，SSW 樣品保留時間約0.25 min 處幾乎無吸收；除此之外，在保留時間約0.49、0.61 和0.89 min 處，SCB 和SSW 樣品吸收呈現(xiàn)明顯不同。

圖1 北五味子（A）和南五味子（B）總紫外吸收指紋圖譜（n = 33）Fig. 1 Total absorbance chromatograms of SCB（A） and SSW（B）（n = 33）

2.4.2 紫外光譜指紋圖譜 充分利用DAD 檢測器性能和挖掘“海量”數(shù)據(jù)內(nèi)在隱藏信息，使得到的紫外光譜指紋圖譜更加穩(wěn)定可靠。對比SCB 和SSW 樣品總流出曲線圖，直觀可見，在保留時間為0.13 min（色譜峰1）和0.25 min（色譜峰2）處，SCB 和SSW明顯不同。因此，對保留時間為0.13 min 和0.25 min處產(chǎn)生的“色譜峰”頂點處的平均紫外掃描光譜（190 ～400 nm）數(shù)據(jù)進(jìn)行提取、導(dǎo)出、合并，結(jié)果如圖2 所示。直觀分析可見，保留時間約0.13 min處色譜峰的平均紫外光譜（圖2A、圖2B）較為相似；保留時間約0.25 min 處色譜峰的紫外光譜輪廓呈現(xiàn)不同特點（圖2C、圖2D），在211、253 nm 附近SSW 樣品出現(xiàn)2 個明顯的吸收峰，明顯強(qiáng)于SCB樣品在211、253 nm 產(chǎn)生的吸收，且SSW 樣品在保留時間約0.25 min 處色譜峰的紫外光譜強(qiáng)度整體上明顯強(qiáng)于SCB 樣品。

圖2 北五味子和南五味子紫外光譜指紋圖譜Fig. 2 Ultraviolet spectra for SCB and SSW

2.5 多元統(tǒng)計分析

2.5.1 PCA 分析 為更加客觀地分析南、北五味子FI-UV 的差異性，將總紫外吸收指紋圖譜（0 ～2 min）數(shù)據(jù)導(dǎo)出、合并，以響應(yīng)值為變量，經(jīng)Log 轉(zhuǎn)換和UV Scaling 處理后，每個樣本總紫外吸收有2 401 個數(shù)據(jù)采集點、第一“色譜峰”和第二“色譜峰”頂點處紫外光譜有211 個數(shù)據(jù)采集點。分別對由 2 401 ×125 形成的數(shù)據(jù)矩陣和211 × 125 形成的數(shù)據(jù)矩陣，共66（22 × 3）個樣本進(jìn)行無監(jiān)督主成分分析（PCA），結(jié)果見圖3。以總流出曲線進(jìn)行PCA 分析，SCB 和SSW 兩組樣品可獲得良好的分類（圖3A），所有SCB 樣品均分布在t[1]象限正值區(qū)域，所有SSW 樣品均分布在t[1]象限負(fù)值區(qū)域；以第一“色譜峰”頂點處紫外光譜進(jìn)行PCA 分析，同樣獲得良好的區(qū)分效果（圖3B）；以第二“色譜峰”頂點處紫外光譜進(jìn)行PCA 分析，分類效果不理想（圖3C）。

圖3 北五味子與南五味子樣品PCA 得分圖Fig. 3 Principal component analysis score of SCB and SSW sample

2.5.2 PLS-DA 分析 在第一色譜峰頂點光譜指紋圖譜無監(jiān)督PCA 分類信息的基礎(chǔ)上，為繼續(xù)縮小組內(nèi)差異，使組間差異最大化，以光譜指紋圖譜 190 ～400 nm 的211 個數(shù)據(jù)點的響應(yīng)值為變量，對66（22 ×3）個樣本進(jìn)行偏最小二乘回歸分析（PLS-DA）。3

南、北五味子所處象限范圍與PCA 分析相一致，組內(nèi)差異變小，組間差異擴(kuò)大，見圖4。由圖4 可知，SCB 樣品分布在t[1]負(fù)值區(qū)域，SSW 分布在t[1]正值區(qū)域，南、北五味子樣品可以達(dá)到較好的區(qū)分效果。PLS-DA 分析與PCA 分析雖然結(jié)果類似，但與PCA 分析結(jié)果相比，組內(nèi)的分布更為集中。PLS-DA作為有監(jiān)督的分類模式，通過縮小組內(nèi)差異和組間差異的最大化，該模型R2X= 0.993，R2Y= 0.988，Q2=0.988，表明該模型穩(wěn)定性好，預(yù)測能力強(qiáng)。

圖4 北五味子與南五味子樣品PLS-DA 得分圖Fig. 4 PLS-DA score of SCB and SSW sample

211、240、253、287 nm 對SCB 和SSW 的區(qū)分起到主要作用，結(jié)合變量的VIP 值大于1 的原則，211、240、253 nm 對南、北五味子的分類起到關(guān)鍵作用，說明這3 個波長對應(yīng)的響應(yīng)值對3 個屬的五味子區(qū)分起到重要作用；考慮到211 nm 靠近紫外末端吸收，可能存在非小分子有機(jī)化合物產(chǎn)生信號，如多糖的特征吸收在190 nm 附近，信號的波動較大，見圖5。因此，綜合考慮240、353 nm 對區(qū)分SCB 和SSW 樣品起到?jīng)Q定作用。分別以211、240、253 nm；240、253 nm 變量為數(shù)據(jù)源進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果見圖6。

圖5 北五味子與南五味子樣品平均紫外光譜和變量系數(shù)圖Fig. 5 Averaged UV spectra and variable coefficient of SCB and SSW sample

圖6 北五味子與南五味子樣品在不同波長紫外吸收PCA 得分圖Fig. 6 SCB and SSW sample's PCA score of UV spectra absorption in different wavelength

由圖6 可知，SCB 和SSW 樣品區(qū)分效果較好。SCB 樣品分布在t[1]象限負(fù)值區(qū)域，遠(yuǎn)離SSW 樣品；SSW 樣品分布在t[1]象限正值區(qū)域。說明變量211、240 和253 nm 對SCB 和SSW 樣品的分類起到重要作用，尤其是240、253 nm 變量對它們的分類起到?jīng)Q定作用。

3 討論

不同產(chǎn)地、采收季節(jié)、種屬、炮制工藝等來源的中藥，其內(nèi)在質(zhì)量通常存在差異性。在中藥鑒別方面，液相色譜指紋圖譜能夠全面地反映樣品的信息，給出更多化學(xué)成分信息，但傳統(tǒng)液相色譜指紋圖譜在中藥鑒別領(lǐng)域往往需要更多的分析時間、消耗更多的試劑。FI-UV 指紋圖譜雖不能提供具體化合物的相關(guān)信息，但能從整體對南、北五味子進(jìn)行快速鑒別，同時FI-UV 最顯著優(yōu)勢在于分析時間短，每個樣品僅需要1 ～2 min，尤其適合大量樣品測試；且利用液相色譜儀的性能，使得紫外光譜具有較高的穩(wěn)定性；樣品前處理簡單，節(jié)約試劑。

紫外光譜指紋圖譜在中藥質(zhì)量評價、產(chǎn)地鑒別等領(lǐng)域已有學(xué)者進(jìn)行有益探索[7]，但未進(jìn)行深入挖掘。由于采樣較為困難，本研究僅對收集到的11 份北五味子和11 份南五味子藥材進(jìn)行FI-UV 測試，其總紫外吸收圖譜和紫外光譜圖輪廓明顯不同。進(jìn)一步利用化學(xué)統(tǒng)計學(xué)手段，充分挖掘大量變量隱藏信息，PCA、PLS-DA 分析結(jié)果并結(jié)合變量VIP 值及紫外吸收特征顯示：對北五味子和南五味子藥材分類起重要作用的變量為211、240 和253 nm，考慮到211 nm接近紫外的末端吸收，干擾比較多，進(jìn)一步以240 和253 nm 為變量進(jìn)行無監(jiān)督PCA 分析，依然能夠取得理想的鑒別效果。FI-UV 從整體角度反映了北五味子與南五味子藥材的化學(xué)成分存在明顯的差異，為五味子類藥材及其它中藥資源的快速鑒別及內(nèi)在質(zhì)量控制提供參考和借鑒。

4 結(jié)論

本研究建立的南、北五味子FI-UV 指紋圖譜方法，能夠快速準(zhǔn)確鑒別南、北五味子，從整體層面反映兩種來源五味子的差異性，同時結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法能夠避免傳統(tǒng)性狀鑒別的主觀性。該方法分析速度快、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好、操作簡便易行，為不同來源的五味子類藥材的鑒別提供了新的參考方法，對藥材科學(xué)鑒別起到促進(jìn)作用。