張 山，秦欣欣，于會勇，王成祥

（北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 呼吸科，北京 100029）

慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持續(xù)性呼吸道癥狀和氣流受限為特征的常見疾病[1]。COPD 常因感染等因素而誘發(fā)加重，且常合并肺外疾病[2]，使得病情復雜反復，因此慢性阻塞性肺疾病全球倡議（GOLD）[1]強調加強COPD 穩(wěn)定期的管理，減少未來急性加重的風險，是COPD 治療的長期目標。目前該病的發(fā)病機制尚未完全闡明，其中炎癥-免疫反應、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、氧化應激損傷等是公認的參與COPD 發(fā)病的重要機制[3]。COPD 的藥物療法多以支氣管擴張劑、吸入用糖皮質激素、抗菌藥物等對癥治療為主[4]，存在療效不佳、副作用大等弊端[5]，中醫(yī)藥治療COPD則有顯著的優(yōu)勢，因此迫切需要尋求針對COPD 更加有效的治療方藥。

都氣丸出自明代秦景明所著《癥因脈治》，由六味地黃丸合五味子組成，是治療腎虛喘嗽的名方。近年來，多項臨床研究表明都氣丸能夠有效改善COPD 患者臨床癥狀及肺功能，減少急性加重發(fā)作次數(shù)，提高患者生活質量[6-8]，發(fā)揮“既病防變”的作用，是治療COPD 的有效方劑?；A實驗已證實都氣丸具有抑制或減輕細胞抗氧化過程，增強機體的免疫作用[9-10]。然而該復方治療COPD 的潛在靶點和作用機制鮮見報道，本研究基于網(wǎng)絡藥理學的系統(tǒng)性、整體性特點，突破傳統(tǒng)分子生物學單靶點研究模式的束縛，與中醫(yī)整體觀、辨證論治思想更為契合[11]，通過構建多成分-多靶點的復雜網(wǎng)狀關系及分子對接，預測都氣丸治療COPD 的分子作用機制，為實驗研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 都氣丸成分及靶點的篩選

依據(jù)中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php） 獲 取 都 氣 丸 中 熟地、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮、五味子的所有活性成分，設定口服生物利用度（Oral bioavailability, OB）≥30%且類藥性（Drug-likeness,DL）≥0.18，初步篩選都氣丸的活性化合物及其作用靶點，并運用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將藥物靶點轉化為標準化基因名稱。

1.2 都氣丸活性成分-靶點網(wǎng)絡構建

運用CytoScape 3.7.1 軟件構建都氣丸活性成分-靶點網(wǎng)絡，進行可視化展示。并利用其內置插件CytoNCA 分析活性成分及網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)，包括點度中心性（Degree centrality, DC）、中介中心性（Betweenness centrality, BC）及接近中心性（Closeness centrality, CC），參數(shù)值越大，說明節(jié)點越接近網(wǎng)絡的中心[12]，從而判斷都氣丸的主要活性成分。

1.3 COPD 相關靶點的篩選

利用Pubmed 平臺獲得“慢性阻塞性肺疾病”病名主題詞“Pulmonary Disease, Chronic Obstructive”為關鍵詞，挖掘GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）、TTD 數(shù) 據(jù) 庫（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）中COPD 的潛在靶點，并根據(jù)數(shù)據(jù)庫靶點的相關系數(shù)對COPD 相關靶點進行篩選，將得到的靶點匯總并去除重復值，得到COPD 相關疾病靶點。

1.4 都氣丸活性成分-COPD靶點蛋白互作網(wǎng)絡的構建

運用線上作圖工具Draw Venn Diagram 將都氣丸活性分子靶點與COPD 疾病靶點做映射取交集，繪制韋恩圖，得到都氣丸與COPD 的共同靶點基因。進而將共同靶點基因導入STRING 11.0 平臺（https://string-db.org/），物種設定為“Homo sapiens”，參數(shù)采用默認設置，構建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡[13]模型，并下載“.tsv”文件，導入CytoScape 3.7.1 軟件進行可視化，同樣利用內置插件CytoNCA 分析相關網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)，得出核心蛋白靶點。

1.5 GO 及KEGG 富集分析

通過Bioconductor 下載clusterProfiler 程序包，運用R 軟件對都氣丸活性成分及COPD 的共同靶點進行GO（Gene ontology）分析及KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）信號通路富集分析，GO 富集分析包括生物過程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和細胞組成（Cellular component，CC）三個模塊。設定P＜0.05，并根據(jù)基因靶點數(shù)目，選擇BP/MF/CC 的前10 個條目以及KEGG 的前20 個信號通路，繪制氣泡圖。

1.6 活性成分-靶點分子對接

借助PubChem平臺下載都氣丸活性成分的“SDF”格式文件，運用Open Babel GUI 軟件將其轉化為“mol2”格式，導入PyRx 軟件進行能量最小化處理，隨后導入Auto Dock Tools 1.5.6 軟件轉化為“PDBQT”格式，作為對接配體。將“1.4”篩選出的排名前5 的主要蛋白靶點，從PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中查找其PDB ID，并下載其三維蛋白結構（PDB 格式），采用PyMol 軟件去水，去除小分子及配體，并導入AutoDock Tools 1.5.6 軟件，加氫，計算電荷，添加原子類型，導出為“PDBQT”格式文件。運行 AutoDock Vina 1.1.2 軟件[14]進行對接，采用PyMol 軟件處理可視化對接結果。

2 結果

2.1 都氣丸活性成分的靶點獲取

結合TCMSP 數(shù)據(jù)庫，經(jīng)OB 及DL 篩選后獲得都氣丸活性成分，其中，熟地2 種，山藥16 種，山茱萸20 種，茯苓15 種，澤瀉10 種，牡丹皮11 種，五味子8 種。剔除無相關靶點的成分27 種，合并重復成分5 種，得到都氣丸活性成分50 種，見表1。同時篩選獲得489 個藥物靶點，合并后刪除重復值共得到靶點203 個。

表1 都氣丸主要活性成分Tab. 1 The main active ingredient of Duqi pill

2.2 都氣丸活性成分-靶點網(wǎng)絡

將都氣丸的50 種活性成分以及203 個藥物靶點導入CytoScape 3.7.1 軟件，構建活性成分-靶點網(wǎng)絡，共獲得260 個節(jié)點，544 條邊，見圖1。其中每個節(jié)點代表化合物分子或作用靶點，節(jié)點與節(jié)點之間的邊代表生物分子間的相互作用，圖中可見節(jié)點越大，相互作用的Degree 值越高，且一個活性分子可作用于多個靶點，多個活性分子可作用于一個靶點，體現(xiàn)了都氣丸多成分、多靶點協(xié)同作用的特點。利用CytoNCA 插件計算網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)，結果表明槲皮素DC 為145，BC 為43 138.527，CC 為0.560 606 06，均為所有活性分子中的最高值，預測槲皮素為都氣丸的主要活性成分。其次為山柰酚（DC 為58，BC為8 994.256，CC 為0.411 111）、β-谷甾醇（DC 為36，BC 為5 805.335，CC 為0.382 006）、豆甾醇（DC為31，BC 為6 336.957，CC 為0.379 765）、海風藤酮（DC 為27，BC 為2 998.726，CC 為0.371 06），前10 位核心化合物見表2。

圖1 都氣丸活性成分-靶點網(wǎng)絡圖Fig. 1 Active component-target network diagram of Duqi pill

表2 前10 位主要活性分子網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)Tab. 2 Characteristic parameters of the top 10 main active molecular network nodes

2.3 COPD 相關靶點的獲取

從GeneCards、OMIM、TTD、DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫檢索“Pulmonary Disease, Chronic Obstructive”，其中在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中共獲得6 060 個COPD 相關靶點，Relevance score 值越高則代表該靶點與疾病聯(lián)系越密切，節(jié)選Score ＞30 的靶點為COPD 的潛在靶點478 個。將以上4 個數(shù)據(jù)庫疾病靶點合并后刪除重復值，最終得到1 053 個COPD 相關靶點。

2.4 都氣丸活性成分-COPD 靶點PPI 網(wǎng)絡的構建

對篩選的都氣丸203 個活性成分靶點與COPD的1 053 個疾病靶點取交集，繪制韋恩圖，得到都氣丸成分-COPD 共同靶點91 個，見圖2。將靶點提交至STRING 11.0 平臺，下載“.tsv”文件，導入CytoScape 3.7.1 軟件，得到都氣丸活性成分-COPD靶點PPI 網(wǎng)絡，見圖3。同樣利用CytoNCA 插件計算網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)，結果表明IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9 等拓撲學參數(shù)值DC、BC、CC 最高，可作為都氣丸治療COPD 的潛在靶點，節(jié)選網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)排名前10 位的靶點，見表3。

圖2 藥物與疾病靶點韋恩圖Fig. 2 Venn diagram of drug and disease targets

圖3 活性成分-疾病靶點PPI 網(wǎng)絡圖Fig. 3 Active ingredient - disease target PPI network diagram

表3 前10 位主要蛋白靶點網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)Tab. 3 Characteristic parameters of the top 10 protein target network nodes

2.5 GO 及KEGG 富集分析

使用 R 軟件對活性分子與疾病的91 個共同靶點進行GO 及KEGG 富集分析，氣泡顏色由紅到藍表示P值由小到大，P值越小顯著性越強，氣泡越大代表該通路的基因計數(shù)count 值越大，橫軸代表該功能富集基因占總體輸入基因的比率。

GO 富集結果共富集2 332 條 GO 功能條目（P＜0.05），其中富集最顯著的 BP、CC、MF 前 10 名結果見圖4。提示都氣丸活性成分可能通過以上生物學反應在治療COPD 過程中發(fā)揮作用。

圖4 GO 分析氣泡圖Fig. 4 GO analyzes bubble graphs

KEGG 富集結果顯示共富集到151 條信號通路，其中排名前20 的富集通路見圖5。靶點通路富集結果（前20 位），見表4。

圖5 KEGG 分析氣泡圖Fig. 5 KEGG analyzes bubble graphs

表4 都氣丸治療COPD 靶點通路富集結果（前20 位）Tab. 4 Enrichment results of Duqi pill in treatment of COPD target pathway（top 20）

2.6 分子對接驗證

將“2.2”中得到的都氣丸的前4 個關鍵活性成分與“2.4”中得到的前5 位核心蛋白靶點進行分子對接，受體蛋白（IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9）相對應的PDB ID 分別為1ALU、1UNQ、5UUI、3QTK、6ESM。配體與受體結合時能量越低，構象越穩(wěn)定，兩者發(fā)生作用的可能性越大。結合能小于0 說明配體與受體可自發(fā)結合，本研究選取結合能≤-5.0 kJ/mol 作為篩選標準[15]。分子對接結果見表5，可以看出都氣丸關鍵活性成分與核心蛋白靶點之間均具有較好的結合活性，其中，槲皮素、山柰酚與5 個核心靶點的結合能均明顯低于β-谷甾醇、豆甾醇、海風藤酮，表明槲皮素、山柰酚與受體蛋白形成構象能量更低。選取槲皮素與山柰酚部分活性成分對接模式見圖6，均有氫鍵作用，說明關鍵分子與靶點蛋白作用結構較為穩(wěn)定，結合活性較高。

圖6 都氣丸關鍵活性化合物與核心蛋白靶點分子對接模式Fig. 6 Docking mode between key active compounds and core protein target molecules of Duqi pill

表5 關鍵活性成分與核心蛋白靶點分子對接的結合能Tab. 5 Binding energy of key active ingredients and core protein target molecules

3 討論

本研究首先采用TCMSP 平臺篩選，共獲得都氣丸活性成分50 種，進一步通過網(wǎng)絡拓撲學分析得出都氣丸治療COPD 的關鍵活性分子為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、海風藤酮等。其中，槲皮素、山柰酚為植物黃酮類化合物，β-谷甾醇、豆甾醇為植物甾醇類化合物，均具有明確的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理特性[16-19]。COPD 相關基礎研究表明，槲皮素可通過降低經(jīng)彈性蛋白酶/脂多糖處理的COPD 小鼠體內的氧化應激水平，抑制促炎細胞因子表達以及基質金屬蛋白酶MMP9、MMP12 的表達，改善肺彈性、減輕肺部炎癥以及杯狀細胞上皮化生，從而阻止肺氣腫的進展[20]，同樣可以減弱鼻病毒誘導的COPD 表型小鼠的肺部疾病進展[21]，并且具有松弛支氣管平滑肌的作用[22]，有望成為治療COPD的新型治療藥物[23]。山柰酚可通過調節(jié)促炎相關通路NF-κB 的激活[24]，以及LPS 刺激的J774.2 巨噬細胞中IL-1 和TNF -α 合成[25]，發(fā)揮重要的抗炎作用。分子對接驗證結果亦證實槲皮素和山柰酚兩者與COPD 核心蛋白靶點作用結構更穩(wěn)定，具有較高的結合活性。β-谷甾醇、谷甾醇的抗炎機制可通過降低NO的合成, 抑制巨噬細胞分泌炎性因子來實現(xiàn)[26-27]，且β-谷甾醇具有較強的抑菌活性，能夠抑制枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細菌的生長[28]。海風藤酮亦具有抗氧化活性[29]，然而尚無與COPD 相關的報道，這就為COPD 相關治療藥物的研究提供一定借鑒。

PPI 網(wǎng)絡圖顯示，都氣丸治療COPD 的潛在靶點有多個，靶點之間也具有復雜的相互作用關系，體現(xiàn)了中藥復方治療COPD 多靶點、多突破點、多成分的特征。進一步根據(jù)網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)結果，證明IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9 是主要靶標。IL-6 主要是由單核巨噬細胞和T 細胞產(chǎn)生的全身性促炎細胞因子，參與COPD 急性加重過程，是反映COPD 嚴重程度與預后的重要生物標記物[30]；同時IL-6 在穩(wěn)定期患者中也高表達[31]，長期IL-6 參與的炎癥刺激導致氣道阻塞、氣道及血管重塑，進一步繼發(fā)肺氣腫和肺動脈高壓的形成[32]。AKT1 是一類進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶最具特征的家族成員之一，與細胞存活、凋亡、炎癥等過程密切相關，其上游負性調節(jié)基因PTEN 的突變可導致AKT的持續(xù)激活，使得COPD 患者即使戒煙后仍存在持續(xù)性炎癥狀態(tài)[33]，同時AKT 也參與COPD 患者的骨骼肌萎縮機制，加速骨骼肌肌纖維蛋白的消耗[34]。TNF 尤其TNF-α 是在COPD 疾病中研究最多的細胞因子之一，TNF-α 是較為公認的COPD 易感基因[35]，可激活巨噬細胞，增加細胞毒性，同時也能刺激IL-6 分泌，誘導炎癥細胞的積累，進一步引起氧化應激、組織重構等，促進COPD 的發(fā)生發(fā)展[36]。MMP-9 是基質金屬蛋白酶（MMPs）家族中分子量最大的多功能酶，由中性粒細胞合成，是評估COPD的重要標志物[37]。MMP-9 可破壞肺實質中細胞外基質成分，亦可激活和釋放生長因子如血管內皮生長因子A（VEGFA），誘導肺部血管新生與血管重塑[38]，是COPD 并發(fā)肺癌的重要機制之一[39]。 以上5 個潛在靶點與COPD 的發(fā)病機制密切相關，并且與GO分析生物學功能富集程度較高的對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、活性氧代謝過程、抗氧化反應、細胞因子的活性等存在一致性，因此可作為都氣丸治療COPD 的核心靶點，指導下一步的實驗驗證。

結合KEGG 通路富集及文獻分析，富集程度最高的通路中，涉及病毒在內的病原體感染以及炎癥相關的通路最多，與COPD 急性加重機制或炎癥發(fā)病機制類似。其中，腫瘤壞死因子TNF、細胞因子IL-17 信號通路均可介導NF-κB、MAPKs 信號通路發(fā)揮抗炎作用[40-41]；COPD 缺氧狀態(tài)下，引發(fā)肺組織細胞缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路的激活，進而增加VEGF 的表達，在COPD 血管生成和氣道重構中發(fā)揮重要作用[42]。

4 結論

基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，都氣丸治療COPD 的活性分子主要為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇等，并與核心靶點IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9 有較好的對接活性，作用于多條感染及炎癥相關通路，體現(xiàn)了都氣丸治療COPD 的多成分、多靶點、多通路聯(lián)合作用的特點，這將為后續(xù)進一步開展相關基礎實驗研究提供理論依據(jù)。