呂李飛，吳俊松，茍江騰，趙成周，徐衛(wèi)松，李忠寬，賈守寧，祁永福*

［1. 青海大學(xué) 青海省糖脂代謝疾病防控中醫(yī)藥重點實驗室，青海 西寧 810016；2. 生物芯片北京國家工程研究中心（博奧生物），北京 102266；3. 青海大學(xué) 藏醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；4. 華大基因，廣東 深圳 518083；5. 青海省中醫(yī)院 科研所，青海 西寧 810012］

慢性心衰（Chronic heart failure，CHF）是指各種心臟結(jié)構(gòu)或功能異常，致使心室充盈或射血功能受損，心排血量不能滿足機體組織代謝需要而引起的一系列綜合征，是多種心血管疾病的主要死因。目前常規(guī)西藥治療已進入神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的時代，沙庫巴曲纈沙坦、維利西呱是臨床主要用藥，雖可穩(wěn)定病情，但多數(shù)患者的預(yù)后仍未達期望。傳統(tǒng)中藥在慢性心系疾病的治療過程中，經(jīng)驗積累頗豐，國內(nèi)專家將中西藥的聯(lián)合干預(yù)擬定了共識指南，供研究參考[1]。

早期生長反應(yīng)蛋白1（Early growth response dene 1，EGR1 ）是多種心血管系統(tǒng)疾病的抑制因子，EGR1的活性異常可激活下游抑制因子的功能網(wǎng)絡(luò)，形成正反饋關(guān)系進而產(chǎn)生某些疾病的標(biāo)志蛋白[2-3]。虛擬篩選通過模擬小分子在靶蛋白結(jié)合位點的行為來闡述基礎(chǔ)生理過程。相比傳統(tǒng)篩選不僅節(jié)省了勞動成本，也降低了開發(fā)成本。研究表明虛擬篩選陽性率為5% ～30%，虛擬篩選已成為最有前途的藥物開發(fā)工具[4]?；蛐酒瑢⒒蚪M學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的優(yōu)勢結(jié)合，可獲取CHF 標(biāo)志基因EGR1 的表達信息，代謝組學(xué)通過整合中藥多成分、多途徑的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，能發(fā)現(xiàn)并闡明巴西蘇木素（Brazilin）治療慢性心衰的物質(zhì)代謝基礎(chǔ)。本研究在虛擬篩選的基礎(chǔ)上，聯(lián)合基因芯片、代謝組學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)研究的高通量檢測技術(shù)，旨在初探Brazilin 改善慢性心衰代謝紊亂的作用物質(zhì)，建立虛擬篩選化合物的快速評價方式，也為虛擬篩選與多組學(xué)技術(shù)相結(jié)合的研究模式提供參考依據(jù)[5-6]。

1 基因芯片的試驗研究

1.1 資料與方法

1.1.1 主要試劑及儀器 100 rxns 型真核生物多ARNA 控制試劑盒（批號：900433）、30 rxns 型真核生物雜交控制試劑盒（批號：900454）均購自美國Affymetrix 公司，?20 ℃貯存，30 rxns 型雜交、洗滌；染色試劑盒（批號：900720）購自美國Affymetrix公司，4 ℃貯存；100 rxns 型擴增試劑盒（批號：1792）購自美國Ambion 公司，?20 ℃貯存；CJT-16 型超凈工作臺（北京長城）；5415D 型微量臺式離心機（Eppendorf中國有限公司）；TDX-1 型渦旋混合器（上海鼎國生物公司）；PTC-225 型PCR 儀（美國MJ Research公 司）；AM10027 型 磁 力 架-96（美 國Ambion 公司）；ND-1000 型紫外分光光度計 （美國NanoDrop 公司）；GDS-7600 型凝膠成像儀（美國UVP 公司）；640 型分子雜交爐、450 型基因芯片洗滌工作站、3000 型基因芯片掃描系統(tǒng)（美國Affymetrix 公司）。

1.1.2 研究資料及分組 研究對象均來自2018 年11 月至2020 年5 月青海省中醫(yī)院。試驗組為30 名符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》的患者（相應(yīng)納入、排除標(biāo)準均參照指南）[1]，其中，男14 例，女16 例，平均年齡（77.00 ± 8.76）歲；對照組為30名健康人，男11 例，女19 例，平均年齡（74.30 ±8.65）歲，兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本試驗研究經(jīng)青海省中醫(yī)院倫理委員會批準（編號：qhszyy1102201601）。

1.1.3 表達譜芯片實驗步驟 兩組研究對象均在清晨安靜空腹?fàn)顟B(tài)下，采用抗凝管收集前臂靜脈血。隨機抽取兩組中各10 例外周血用于有核細胞基因表達譜的差異檢測，檢測方法采用Affymetrix mRNA 表達譜芯片[7]，本部分由北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。1.1.4 差異表達基因EGR1的選取 采用PrimeViewTMHuman Gene Expression Array 基因芯片檢測，芯片清洗染色后AGCC 軟件分析芯片的熒光圖像，再通過R 語言包進行RNA 差異表達分析。差異基因設(shè)定P＜ 0.05和|log2（fold change）| ＞1.2為篩選條件。log2（fold change）＞ 1.2 為 基 因 上 調(diào)；log2（fold change）＜?1.2 為基因下調(diào)。

1.2 基因芯片結(jié)果

本研究中，CHF 患者與健康人相比，共23 497個上調(diào)基因（EGR1、CCR7、FOS、MYC等），25 125個 下 調(diào) 基 因（RAP1GAP2、STAT4、AKT1 等）。得出mRNA 中EGR1 的log2FC（Fold Change） 值 為39.397，為上調(diào)最顯著的基因，也是可篩選的疾病標(biāo)志基因，以EGR1為靶標(biāo)的抑制劑可干預(yù)CHF，見圖1。

圖1 試驗組vs 對照組熱圖Fig. 1 Heat map of text group vs control group

2 慢性心衰EGR1 靶向抑制劑的虛擬篩選

2.1 虛擬篩選條件的構(gòu)建

2.1.1 化合物庫的準備 本研究主要基于Sellect和Targetmol 公司的化合物實體庫以及DrugBank 收錄的化合物庫。從https://www.selleck.cn/，https://targetmol.com/ 和https://www.drugbank.com/ 下載得到SDF 格式的化合物，再利用Schr?dinger Maestro|Calculate 模塊對化合物庫數(shù)據(jù)進行理化性質(zhì)的計算，并根據(jù)Lipinski 規(guī)則[4]過濾，篩得約30 000個化合物，最后選用力場OPLS3e 對其進行質(zhì)子化和能量最小化處理。

2.1.2EGR1 蛋白結(jié)構(gòu)的準備EGR1 蛋白晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID: 4R2D，Resolution: 2.15 ?）從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫下載(https://www.rcsb.org/structure/4R2D )。經(jīng)Maestro11.9 平臺處理蛋白結(jié)構(gòu)，再用Schr?dinger 的Protein Preparation Wizard 處理蛋白，去除結(jié)晶水，添加缺失的H 原子，并修復(fù)缺失鍵信息及肽段，最后對蛋白進行能量最小化和幾何結(jié)構(gòu)的優(yōu)化[4]。

2.1.3 分子對接 采用Schr?dinger Maestro的Glide模塊對虛擬篩選結(jié)果進行優(yōu)化，蛋白質(zhì)處理采用Protein Preparation Wizard 模塊，受體則進行預(yù)處理、優(yōu)化。所有化合物均按LigPre 模塊的默認設(shè)置制備。在Glide 模塊中進行篩選，導(dǎo)入制備好的受體，在受體網(wǎng)格生成中指定合適的位置，選取蛋白的原配體作為10? 盒子的質(zhì)心。將原配體再次對接，確認對接方法的可行性。經(jīng)標(biāo)準精度（Standard Precision Method，SP）對接后篩選，再利用額外精度（Extra Precision Method，XP）對接模板篩出SP 打分較高的前配體[4]。

2.2 虛擬篩選結(jié)果

2.2.1 結(jié)合模式及方法有效性分析EGR1 （4R2D）蛋白的晶體結(jié)構(gòu)精度高，無關(guān)鍵殘基缺失，通過陽性化合物進行多次測試，確定陽性化合物與活性位點的結(jié) 合 模 式。LYS-366、SER-378、HIS-382、ARG-379、ARG-357、GLU-354、PHE-349 等關(guān)鍵殘基為穩(wěn)定配體發(fā)揮著重要的作用，如：HIS-382 的五元環(huán)能與陽性化合物的苯環(huán)形成π-π 共軛，對蛋白口袋中小分子的穩(wěn)定有較大貢獻。為確定合適的對接方案，用于篩選潛在的活性化合物，我們將對接后的陽性化合物再次對接到EGR1 結(jié)合位點上。結(jié)合位點在化合物中的前后一致性，表明篩選有效，見圖2。

圖2 沙庫巴曲纈沙坦與 EGR1 對接模式分析Fig. 2 The docking model and analysis of EGR1 with Sacubitril

2.2.2EGR1 配體及關(guān)鍵氨基酸篩選 根據(jù)SP 精度的篩選結(jié)果，再取分值小于?5.0 的化合物進行XP篩選，同時將6 種陽性化合物配體作為對照，分析陽性化合物與EGR1 作用模式，綜合2 次篩選結(jié)果明確作用的關(guān)鍵氨基酸，見圖3。再將陽性化合物與EGR1 進行柔性對接模式驗證，選出打分較高且結(jié)合模式合理的化合物，并通過結(jié)合模式的對比分析，得出陽性化合物主要與LYS366、GLU354、ARG357、ARG379、SER378 等氨基酸殘基形成氫鍵相互作用或共軛相互作用，這些化合物成為EGR1 配體的可能性大，見表1。

圖3 陽性化合物與EGR1 作用模式Fig. 3 Modes of interaction between positive compounds and EGR1

表1 配體及氨基酸篩選結(jié)果Tab. 1 Ligand and amino acid screening results

2.2.3 Brazilin 的優(yōu)先篩選 經(jīng)SP、XP 篩選后，Brazilin 的結(jié)合能較低，為?9.30 kcal/mol，結(jié)合能越低代表化合物與蛋白結(jié)合能力越強，同時Brazilin 的結(jié)合位點包括THR385、SER378、HIS382、PHE377等氨基酸殘基，與陽性化合物的接觸位點較一致，見圖4。由于Brazilin 含有較多相連的六元環(huán)，所以該化合物具有一定的剛性，但該化合物兩端的苯環(huán)均能與蛋白的氨基酸（HIS382、PHE377）形成較好的π-π 共軛相互作用，有利于錨定分子在口袋中的“口袋因子”（具有穩(wěn)定性的疏水性分子）；同時其六元環(huán)的羥基與多個氨基酸的活性基團均能夠形成兩個氫鍵（1.8?），氫鍵距離較短，結(jié)合較強；此外，該化合物與蛋白的活性口袋還存在較強的疏水作用和范德華力。這些相互作用力對提高Brazilin 與EGR1 活性口袋的穩(wěn)定性有重要作用，因此Brazilin 是本研究的優(yōu)先篩選。

圖4 Brazilin 與EGR1 靶蛋白的結(jié)合模式Fig. 4 The binding mode of Brazilin with EGR1 target protein

3 CHF 大鼠代謝組學(xué)的實驗驗證

3.1 實驗材料

3.1.1 試藥與儀器 Brazilin（批號：B20024），鹽酸異丙腎上腺素（批號：S31064）均購自上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清（批號：G8001，武漢賽維爾生物科技有限公司）；大鼠腦鈉素(BNP)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（批號：E-EL-R0126c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；2777C UPLC system 型液相色譜儀、Xevo G2-XS QTOF型質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；ECLIPSE Ci-L 型正置白光拍照顯微鏡（日本尼康公司）；掃描瀏覽軟件CaseViewer2.4、Pannoramic DESK型全景切片掃描儀（匈牙利3DHISTECH 公司）；ZS3 Exp型小動物彩色多普勒超聲診斷儀（中國邁瑞公司）。

3.1.2 動物 SPF 級SD 大鼠40 只，6 周齡，體質(zhì)量為（200 ± 20）g，雄性［由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（陜）2018-001］。飼養(yǎng)條件按動物房常規(guī)條件設(shè)定，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，稱重、分籠及編號，進行實驗。本研究經(jīng)青海省中醫(yī)院倫理委員會審批（編號：qhszyy1103201901）。

3.1.3 分組、造模及干預(yù) 按隨機數(shù)字表法分組：空白組10 只、實驗組30 只，均給予普通飼料分開飼養(yǎng)。實驗組采用異丙腎上腺素誘導(dǎo)CHF 大鼠模型：予大鼠皮下多點連續(xù)注射（sc）10 mg/kg/d，連續(xù)注射14 d[7]，每日稱量大鼠體質(zhì)量，調(diào)整給藥劑量?？瞻捉M注射等量生理鹽水。造模結(jié)束后翌日對所有大鼠進行超聲檢測，檢測前禁食水12 h，參考王曉燕[8]評價標(biāo)準驗證造模是否成功。剔除死亡及未成模的5只大鼠，從25 只成模大鼠中隨機抽取10 只作為模型組，8 只作為Brazilin 組，空白組不變。

空白組和模型組灌服等量生理鹽水。Brazilin 的制備及給藥：稱取0.5 g Brazilin，定容至100 mL，濃縮至臨床等效劑量0.8 g/mL 貯存于4 ℃冰箱備用。給藥的等效劑量根據(jù)大鼠與成人體表面積進行換算，對Brazilin 組進行（1 mL）0.4 g/100g 灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)6 周。給藥期間觀察并記錄各組大鼠的一般情況。灌胃給藥期間Brazilin 組大鼠死亡1 只。標(biāo)本采集前12 h 開始禁食不禁水，最后用烏來糖麻醉大鼠，仰臥于手術(shù)臺上腹主動脈采血，促凝管標(biāo)本離心后取血清檢測BNP 水平，抗凝管收集血液標(biāo)本，2 ～ 3 mL/管并標(biāo)號，將標(biāo)本放置離心機離心，移液管取上層血漿，?80 ℃冰箱保存，用于代謝組學(xué)檢測。

3.2 觀察指標(biāo)

3.2.1 血清BNP 檢測 采用ELISA 法檢測空白組及模型組大鼠腦鈉肽（BNP），按動物模型評價標(biāo)準對CHF 大鼠模型進行評價[7]。

3.2.2 HE 染色 心臟標(biāo)本經(jīng)生理鹽水沖洗，置于4%多聚甲醛溶液中固定，按病理實驗檢測SOP 程序進行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片，最后鏡檢合格的樣片，HE 染色觀察心臟病理學(xué)形態(tài)改變。

3.2.3 心臟超聲檢查 在藥物干預(yù)前對所有大鼠行心臟彩超檢測，操作過程中履行盲法原則。彩超儀測量左心室射血分數(shù)（LVEF）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LEVDD），連續(xù)測3 個心動周期并取平均值，再按Teich 公式計算出左室短軸縮短率（LVFS）。

3.2.4 代謝組學(xué) 每份樣品取40 μL 加入對應(yīng)96孔板中；插入胎牛血清；加入甲醇120 μL 預(yù)冷，封膜后震蕩搖勻1 min， 置于?20 ℃冰箱過夜；4℃，25 000 g 離心15 min；每份樣品再取25 μL 置于新的96 孔板中，加入225 μL 50%甲醇進行稀釋；每個樣再次取50 μL 混合QC；取60 μL 上清液轉(zhuǎn)到96 孔板中，封膜標(biāo)識，并檢測。

3.3 結(jié)果

3.3.1 血清BNP 水平 按大鼠BNP 試劑盒的ELISA 實驗步驟，得出空白組與模型組血清BNP 值分別為（81.95 ± 6.31）和（405.56 ± 28.22）pg/mL，兩者比較差異明顯（P＜ 0.01），符合CHF 造模評價。

3.3.2 HE 染色結(jié)果 空白組大鼠心臟切片視野內(nèi)組織染色均勻，心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、分界清晰、排列規(guī)則，間質(zhì)未見明顯異常，未見明顯炎癥，見圖5A。模型組組織中可見較大量的心肌纖維水腫，胞質(zhì)疏松淡染（黑色箭頭，見圖5B）；組織邊緣多見心肌纖維溶解，被增生的結(jié)締組織取代（黃色箭頭，見圖5B），伴有少量淋巴細胞浸潤（紅色箭頭，見圖5B）。

圖5 大鼠心肌組織形態(tài)觀察（ HE 染色，100×）Fig. 5 Morphological observation of myocardial tissue in rats（HE stain，100×）

3.3.3 心臟彩超結(jié)果 空白組與模型組LVEF 值分別 為（88.73 ± 2.08）% 和（52.54 ± 4.60）%，LVFS值分別為（65.01 ± 6.75）%和（36.76 ± 4.96）%，兩者比較差異明顯（P＜ 0.01），符合CHF 造模評價。

3.3.4 代謝組學(xué)分析結(jié)果 Meta X 軟件獲得組間的差異代謝物[9]，對其進行分類和功能注釋。采用人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫（HMDB）及KEGG 數(shù)據(jù)庫的核心KEGG PATHWAY對差異代謝物進行分類和功能注釋，明確差異代謝物的代謝途徑及信號通路[10-11]。采用多變量的變量權(quán)重值（VIP），結(jié)合單變量分析差異倍數(shù)（FC）≥1.2 或≤0.833 3 和q-value ＜ 0.05，三者取交集得到差異代謝物[12]。

三組大鼠血漿的差異代謝物共209 個，主要分類有：氨基酸類、脂類、有機酸類、類固醇類、嘌呤類、醇類、萜類及黃酮類，見圖6。最顯著富集的通路是苯丙氨酸代謝、酪氨酸合成、2-氧代羧酸代謝，見圖7。

圖6 代謝物分類條形圖Fig. 6 Bar chart of metabolite classification

圖7 代謝通路富集分析氣泡圖Fig. 7 Bubble diagram of metabolic pathway enrichment analysis

4 討論

2020 年版《中國藥典》收載的豆科藥用植物蘇木，主要功效能行氣化淤止痛，巴西蘇木素（Brazilin）是其核心成分[13-14]。相關(guān)研究證實Brazilin具有抗炎、擴血管、延緩心室重構(gòu)等藥效活性。CLAUDIA C等[15]通過PBMC 基因表達譜認為EGR1 表達水平能區(qū)分缺血性和非缺血性擴張性CHF 患者，可作為CHF 的生物標(biāo)志物。WU Y G[16]研究EGR1 的沉默表達能激活PI3K/Akt 通路，調(diào)節(jié)miR-26a/EGR1 軸，進而保護心血管系統(tǒng)。

按VIP 值大小排序，結(jié)合P值和FC值，并匯總可研究的代謝通路，選取最具典型的差異代謝物，主要涉及高同型半胱氨酸、高脫氧膽酸、槲皮素3-（6''-槐花苷）等。三組代謝組學(xué)的關(guān)鍵差異代謝物槲皮素3-（6''-槐花苷），屬黃酮類，在模型組中顯著下調(diào)，但在Brazilin 組中下調(diào)FC值較模型組低，表明Brazilin 干預(yù)有效，作用機制可能與鐵螯合相關(guān)，Brazilin 能緩解蒽環(huán)類藥物誘導(dǎo)的心肌損傷[17]。高同型半胱氨酸是模型組中上調(diào)最明顯的差異代謝物，是氨基酸的異種；脂多糖（LPS）是CHF 的重要毒力因子，研究表明高同型半胱氨酸可介導(dǎo)LPS 發(fā)生促炎反應(yīng)，主要機制是通過TLR4/NF-κB 炎癥通路誘導(dǎo)心肌細胞肥大，使其糖脂代謝及結(jié)構(gòu)排列紊亂[18]。而Brazilin組中高同型半胱氨酸較模型組明顯降低，表明Brazilin 能抑制心血管炎癥反應(yīng)，可啟動miR-27a-3p 產(chǎn)生心血管的保護作用[19]，延緩心室重構(gòu)；高脫氧膽酸通過激活NF-κB 通路促進成熟炎癥因子的表達，因而在模型組中表達明顯上調(diào)，但Brazilin 干預(yù)后高脫氧膽酸的表達含量下調(diào)。結(jié)果表明Brazilin可調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的自噬平衡而發(fā)揮心室保護作用[20]，這可能與Brazilin 調(diào)控miR-27a-3p/EGR1 軸、TLR4/NF-κB 通路密切相關(guān)。

嘌呤堿途經(jīng)2-氧代羧酸通路代謝最終生成尿酸，尿酸容易沉著在血管壁，損傷血管內(nèi)皮細胞；糖脂過氧化反應(yīng)會導(dǎo)致動脈狹窄，加重CHF 癥狀；絡(luò)氨酸的代謝異常，會引發(fā)心肌血管內(nèi)皮受損，而苯丙氨酸、絡(luò)氨酸的合成又與TLR4/NF-κB通路相關(guān)[21-22]。

綜上所述，Brazilin 對慢性心衰的治療是通過多基因、多靶點、多通路的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。Brazilin 可改善高脫氧膽酸、高同型半胱氨酸及槲皮素3-（6''-槐花苷）的代謝，成為治療CHF 的可能，但其具體作用機制值得進一步深入研究。

5 結(jié)論

選取虛擬篩選中與EGR1 結(jié)合較好的Brazilin，經(jīng)代謝組學(xué)實驗證實可用于CHF 的治療。但研究尚有不足，針對Brazilin 在慢性心衰的治療作用機制闡述尚淺，后續(xù)將進行Brazilin 的體外酶活測定，并從分子水平探究Brazilin 的作用機制，有望為以Brazilin 為核心的藥物開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。