張 寧，徐 劍,2,3*，徐 雪，劉 明,2,3，繆艷燕,2,3，張永萍,2,3，周雪嬌

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中藥民族藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025；3.國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025）

提取方法是影響中藥臨床療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-2]。目前中藥提取方法有煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流法、索氏提取法、水蒸氣蒸餾法等，傳統(tǒng)加熱方式在提取過程中存在效率低、能耗高等問題[3]，建立綠色節(jié)能高效的提取方式是提高中藥制造業(yè)現(xiàn)代化水平的需求[4]。微波加熱是對物質(zhì)內(nèi)外同時整體進(jìn)行加熱，在提取效率上優(yōu)于傳統(tǒng)提取技術(shù)[5-7]。由于微波產(chǎn)生熱源的方式不同于傳統(tǒng)加熱方式，勢必影響中藥提取過程中成分的浸出，對藥效是否產(chǎn)生影響還有待驗證。為了探討微波加熱對藥效的影響，本研究以丹參為模型藥，通過腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素建立大鼠急性心肌缺血模型，采用模糊綜合評判法對不同加熱模式丹參提取物的藥效進(jìn)行綜合評價，以期為中藥微波提取物在臨床的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級SD 大鼠50 只，雌雄各半，體質(zhì)量為200 ～ 250 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2014-0011。所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后進(jìn)行試驗。

1.1.2 藥物與試劑 丹參（貴州同濟堂中藥飲片有限公司，批號：C180612）；復(fù)方丹參片（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號：L18A040）；鹽酸異丙腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號：41181101，規(guī)格：2 mL ∶1 mg）；SOD 試劑盒（批號：20190614）、MDA 試劑盒（批號：20190612）、CK 試劑盒（批號：20190614）、LDH 試劑盒（批號：20190614）、總蛋白定量測試盒（批號：20190808）均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 主要儀器 BL-420型生物機能實驗系統(tǒng)（四川成都泰盟科技有限公司）；SK8210 HP 型超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；TGL-16B 型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；OPWO8S 型澳潤微波提取器（南京澳潤微波科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 傳統(tǒng)加熱：稱取丹參適量，用10 倍量95%乙醇加熱回流1.5 h，過濾；濾渣加10倍量50%乙醇回流1.5 h ，過濾；濾渣用10 倍量水回流2 h，過濾，合并三次濾液，減壓濃縮至干浸膏，并放置干燥器中保存。微波加熱基于課題組前期的研究，設(shè)置功率為600 W[8]。其它參數(shù)與傳統(tǒng)提取法一致。

1.2.2 分組、給藥及模型制備 取50 只大鼠分為正常組、模型組、陽性藥物組（復(fù)方丹參片0.6 mg/g）、微波加熱組、傳統(tǒng)加熱組，共5 組，每組10 只。微波加熱組、傳統(tǒng)加熱組的給藥劑量以生藥量計算為5.4 mg/g，正常組、模型組大鼠灌胃給予等容積生理鹽水。大鼠急性心肌缺血模型的建立：大鼠連續(xù)給藥14 d，各給藥組從第12 天給藥30 min 后，除正常組外，其余各組均腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素（0.005 mg/g），每天1 次，連續(xù)3 d。

1.2.3 大鼠心電圖ST段的測定 第14天給藥30 min后，用2%戊巴比妥鈉麻醉，麻醉后將大鼠四肢皮下插入針灸針，連接肢導(dǎo)聯(lián)，記錄肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖，待心電圖穩(wěn)定后腹腔注射ISO（第三次），測定大鼠注射ISO 后5、15、30、60、180、300、600、900 s二導(dǎo)聯(lián)心電圖的ST 段[9]。

1.2.4 大鼠血流動力學(xué)及心肌力學(xué)的測定 心電圖檢測后將大鼠頸部正中切開皮膚，將事先充滿0.3%肝素鈉生理鹽水的留置針通過左側(cè)頸總動脈，插到左心室，連接多道生理記錄儀，檢測是否插管成功[10]。成功后腹腔注射ISO（第三次）并記錄左室內(nèi)壓最大上升/下降速率（± dp/dtmax）。

1.2.5 大鼠血清LDH、CK、MDA、SOD 的測定

在大鼠心電圖和血流動力學(xué)測定后腹主動脈取血，收集血液，于4℃靜置，離心（5 min，2 000 r/min），取血清分裝，置-80℃冰箱備用，按照試劑盒說明進(jìn)行檢測。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。1.2.7 模糊綜合評判法 確定評價指標(biāo)、評語等級集和各指標(biāo)評價等級標(biāo)準(zhǔn)范圍，建立因素的權(quán)重集與評價因素之間的模糊關(guān)系，根據(jù)數(shù)學(xué)模型[11]，B =W*R 評判結(jié)果，建立評價因素的模糊關(guān)系矩陣。通過綜合評分Y = B*C，得到綜合評分結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 對大鼠心電圖ST 段變化的影響

與正常組相比，模型組ST 段升高（P＜ 0.05），表明造模成功。與模型組比較，各給藥組均能降低ST 段變化（P＜ 0.05），各給藥組與陽性藥物組相比、微波加熱組與傳統(tǒng)加熱組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明微波加熱沒有改變藥效，具體見表1。

表1 造模后不同時間點大鼠ST 段的變化情況（mv，n = 10，±s）Tab. 1 Changes in ST segment of rats at different time points after modeling（mv，n = 10，±s）

表1 造模后不同時間點大鼠ST 段的變化情況（mv，n = 10，±s）Tab. 1 Changes in ST segment of rats at different time points after modeling（mv，n = 10，±s）

注：同列字母完全不同，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P ＜ 0.05，下表同。

組別 5 S 15 S 30 S 60 S 180 S 300 S 600 S 900 S正常組 0.04 ± 0.03a 0.02 ± 0.01a 0.03 ± 0.03a 0.05 ± 0.03a 0.05 ± 0.03a 0.09 ± 0.07a 0.05 ± 0.03a 0.06 ± 0.04a模型組 0.17 ± 0.05b 0.20 ± 0.05b 0.21 ± 0.03b 0.21 ± 0.04b 0.19 ± 0.05b 0.20 ± 0.05b 0.18 ± 0.03b 0.16 ± 0.04b陽性藥物組 0.06 ± 0.07a 0.06 ± 0.08a 0.04 ± 0.04a 0.04 ± 0.03a 0.05 ± 0.05a 0.06 ± 0.03a 0.03 ± 0.02a 0.09 ± 0.07a微波加熱組 0.05 ± 0.03a 0.05 ± 0.03a 0.02 ± 0.02a 0.01 ± 0.01a 0.03 ± 0.05a 0.06 ± 0.05a 0.05 ± 0.03a 0.06 ± 0.07a傳統(tǒng)加熱組 0.03 ± 0.05a 0.04 ± 0.04a 0.06 ± 0.04a 0.02 ± 0.02a 0.04 ± 0.07a 0.03 ± 0.04a 0.04 ± 0.07a 0.02 ± 0.04a F 8.285 12.920 27.227 42.811 9.001 8.856 11.499 4.372 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.011

2.2 不同提取方式對大鼠血流動力學(xué)的影響

模型組在注射ISO 后各時間點，與正常組相比-dp/dtmax 升高（P＜ 0.05），+dp/dtmax 降低（P＜0.05），表明大鼠在造模后心肌收縮、舒張功能受損。與模型組比較，各給藥組-dp/dtmax 降低（P＜ 0.05）、+dp/dtmax 升高（P＜ 0.05），各給藥組與陽性藥物組相比、微波加熱組與傳統(tǒng)加熱組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），說明各給藥組均能改善心肌收縮、舒張功能，微波加熱并沒有改變藥效，具體見表2、3。

表2 造模后不同時間點大鼠左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)的變化情況（mmHg，n = 10，±s）Tab. 2 Changes in the maximum rate of increase of left ventricular pressure (+dp/dtmax) in rats at different time points after modeling（mmHg，n = 10，±s）

表2 造模后不同時間點大鼠左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)的變化情況（mmHg，n = 10，±s）Tab. 2 Changes in the maximum rate of increase of left ventricular pressure (+dp/dtmax) in rats at different time points after modeling（mmHg，n = 10，±s）

組別 5 S 15 S 30 S 60 S 180 S 300 S 900 S正常組 10 062.87 ± 2 487.67a 11 254.58 ± 2 041.36a 10 385.13 ± 1 662.76a 11 111.45 ± 1 707.96a 11 003.72 ± 1 380.70a 10 844.73 ± 983.49a 11 237.79 ± 1 362.43a模型組 7 052.25 ± 2 055.71b 6 837.46 ± 894.95b 7 443.18 ± 306.84b 6 790.77 ± 868.09b 6 784.36 ± 1 560.69b 7 564.29 ± 708.22b 7 832.34 ± 2 773.65b陽性藥物組 10 513.00 ± 1 627.81a 10 170.59 ± 1 572.63a 10 405.58 ± 1 932.11a 10 766.60 ± 1 617.72a 11 223.75 ± 715.43a 10 835.98 ± 947.93a 11 800.23 ± 679.34a微波加熱組 9 786.68 ± 1 512.06a 10 082.09 ± 1 705.63a 10 760.19 ± 1 731.07a 10 805.97 ± 2 005.60a 11 029.97 ± 1 983.58a 11 011.35 ± 1 432.33a 11 058.35 ± 1 142.46a傳統(tǒng)加熱組 10 156.86 ± 1 259.81a 10 234.99 ± 1 466.10a 10 326.23 ± 1 188.26a 9 357.30 ± 1 907.93a 10 014.04 ± 1 752.43a 10 808.41 ± 1 616.26a 11 109.92 ± 1 907.52a F 3.306 4.505 3.383 4.628 5.863 7.220 3.353 P 0.039 0.014 0.037 0.012 0.005 0.002 0.038

表3 造模后不同時間點大鼠左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)的變化情況（mmHg，n = 10，±s）Tab. 3 Changes in the maximum drop rate of left ventricular pressure (-dp/dtmax) in rats at different time points after modeling（mmHg，n = 10，±s）

表3 造模后不同時間點大鼠左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)的變化情況（mmHg，n = 10，±s）Tab. 3 Changes in the maximum drop rate of left ventricular pressure (-dp/dtmax) in rats at different time points after modeling（mmHg，n = 10，±s）

組別 5 S 15 S 30 S 60 S 180 S 300 S 900 S正常組 -6 991.37 ± 1 713.24a -7 751.46 ± 1 737.09a -7 843.63 ± 1 923.77a -8 234.86 ± 1 161.48a -8 671.26 ± 969.51a -8 158.87 ± 619.92a -9 421.39 ± 1 676.20a模型組 -3 991.46 ± 1 119.39b -4 172.97 ± 545.89b -3 896.48 ± 478.60b -3 665.77 ± 840.41b -4 442.75 ± 891.17b -5 159.51 ± 430.16b -4 631.96 ± 1 505.10b陽性藥物組-7 155.15 ± 2 353.54a -7 256.77 ± 2 341.13a -7 316.89 ± 2 442.70a -7 038.57 ± 2 692.42a -7 902.53 ± 2 393.37a -7 069.50 ± 2 206.22a -8 725.28 ± 2 334.10a微波加熱組-6 803.89 ± 447.18a -7 335.82 ± 638.83a -7 484.74 ± 660.83a -7 378.54 ± 1 043.99a -7 050.78 ± 1 596.22a -7 734.38 ± 796.43a -7 790.83 ± 1 391.86a傳統(tǒng)加熱組-7 399.60 ± 1 122.44a -7 588.50 ± 838.51a -6 871.03 ± 835.94a -6 307.37 ± 1 354.32a -7 264.71 ± 2 097.73a -7 335.51 ± 1 653.14a -7 678.83 ± 1 885.14a F 3.481 4.502 4.619 4.963 3.538 3.441 3.566 P 0.033 0.014 0.012 0.009 0.032 0.035 0.031

2.3 對大鼠血清LDH、CK、MDA、SOD 的影響

模型組血清中LDH、CK、MDA 含量高于正常組（P＜ 0.05），SOD 含量低于正常組（P＜ 0.05）。其它各給藥組LDH、CK、MDA 含量低于模型組（P＜ 0.05），SOD 的含量高于模型組（P＜ 0.05），各給藥組與陽性藥物組相比、微波加熱組與傳統(tǒng)加熱組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。說明各給藥組對心肌組織具有保護(hù)作用，微波加熱沒有改變藥效，具體見表4。

表4 丹參不同提取方法對大鼠血清中LDH、CK、SOD、MDA 的影響（n = 10，±s）Tab. 4 Effects of different extraction methods of Salvia miltiorrhiza on LDH, CK, SOD and MDA in rat serum（n = 10，±s）

表4 丹參不同提取方法對大鼠血清中LDH、CK、SOD、MDA 的影響（n = 10，±s）Tab. 4 Effects of different extraction methods of Salvia miltiorrhiza on LDH, CK, SOD and MDA in rat serum（n = 10，±s）

組別 劑量/ （mg/kg） LDH /（U/L） CK /（U/mL） SOD /（U/mL） MDA /（nmol/mL）正常組 - 3 118.59 ± 1 223.58a 9.76 ± 2.30a 252.10 ± 14.27a 3.12 ± 0.38a模型組 - 4 628.97 ± 726.01b 12.63 ± 2.81b 205.57 ± 38.89b 6.26 ± 1.67b陽性藥物組 0.6 2 928.66 ± 809.53a 9.92 ± 2.13a 252.50 ± 19.88a 4.19 ± 0.30a微波加熱組 5.4 3 373.66 ± 1 330.80a 8.16 ± 1.57a 240.07 ± 29.72a 4.47 ± 0.82a傳統(tǒng)加熱組 5.4 3 657.12 ± 1 435.03a 8.80 ± 0.93a 229.66 ± 23.63a 4.68 ± 0.85a F 3.024 4.182 3.441 8.693 P 0.042 0.010 0.023 0.000

2.4 模糊綜合評判法結(jié)果

2.4.1 確定評價指標(biāo)U U = {u1, u2, …, u7} = {ST段、+ dp/dtmax,…,MDA}

2.4.2 確定評語等級集V V = {v1, v2, v3, v4} ={好、較好、一般、差}

2.4.3 確定各指標(biāo)評價等級標(biāo)準(zhǔn)范圍根據(jù)各指標(biāo)的均數(shù)、頻數(shù)分布確定等級范圍見表5。

表5 各指標(biāo)評價等級標(biāo)準(zhǔn)范圍Tab. 5 The scope of the evaluation grade standard of each index

2.4.4 建立因素的權(quán)重集 采用上述的層次分析法所獲得的權(quán)重系數(shù)來建立因素的權(quán)重集。

2.4.5 建立評價因素的模糊關(guān)系 根據(jù)急性心肌缺血實驗所獲得的各項指標(biāo)的實測值在其評價等級范圍內(nèi)的頻數(shù)分布建立模糊關(guān)系。

2.4.6 模糊綜合評價 根據(jù)數(shù)學(xué)模型，B=W*R 評判結(jié)果，其中，W 為各指標(biāo)權(quán)重組成的向量，R 為各指標(biāo)隸屬度向量組成的矩陣，B 為綜合評判的結(jié)果向量，按照最大隸屬度原則分別對不同加熱方式產(chǎn)生的藥效結(jié)果進(jìn)行綜合評價。根據(jù)各評價因素對藥效的影響程度，采用強制決定法[12]，確定各評價因素權(quán)重分別為ST 段（0.2）、+dp/dtmax（0.2）、-dp/dtmax（0.2）、急性心肌缺血（0.4）。因此，W={0.2、0.2、0.2、0.4}。

建立評價因素的模糊關(guān)系矩陣。

根據(jù)公式B = W*R 可得：

B微波= （0.317，0.525，0.117，0.050）

B傳統(tǒng)= （0.464，0.350，0.117，0.050）

為了更好的評價藥效，我們選擇各分?jǐn)?shù)區(qū)間的中值作為等級的參數(shù)，則參數(shù)項為CST段= {0.03，0.09，0.15，0.21}，C+dp/dtmax= {5 068.52，9 650.26，8 460.7，7 343.14}，C-dp/dtmax= {-3 991.25，-7 263.05，-5 824.14，-4 385.23}，CLDH= {2 523.5，3 332.5，4 141.5，4 950.5}，CCK= {7.7，9.9，12.11，14.32}，CSOD= {258，232，206，180}，CMDA= {4.395，5.405，6.415，7.425}。綜合評分Y = B*C，結(jié)果見表6。通過對7 個藥效指標(biāo)進(jìn)行綜合評分，微波加熱藥效的綜合評分均大于傳統(tǒng)加熱藥效的綜合評分。

表 6 不同加熱方式丹參藥效的綜合評分Tab. 6 Comprehensive scores of Salvia miltiorrhiza with different heating methods

3 討論

據(jù)清代《本草逢源》記載，丹參具有“活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰”等功效[13]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明丹參對心肌缺血具有保護(hù)作用，因此本實驗采用腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素致大鼠急性心肌缺血，異丙腎上腺素可以興奮心臟，增強心肌功能，連續(xù)大劑量注射使心肌耗氧增加，大鼠由于心肌供氧不足引起心肌能量代謝障礙導(dǎo)致心電圖ST 段產(chǎn)生抬高或壓低的異常變化，導(dǎo)致左心室縮/舒功能異常，其中，左室內(nèi)壓最大上升/下降速率（±dp/dtmax）可以反映心肌收縮和舒張能力的變化情況。由于心肌組織處于缺血缺氧狀態(tài)，心肌細(xì)胞受損，LDH、CK 外漏，導(dǎo)致血液中LDH、CK 含量增加，氧自由基增加，導(dǎo)致消除自由基SOD 的減少，過氧化物MDA 的增多[14]。所以本實驗通過大鼠心電圖ST 段變化，血流動力學(xué)指標(biāo)、心肌酶等多指標(biāo)進(jìn)行考察，比較不同加熱模式下丹參提取物藥效的差異性。

結(jié)果表明，不同加熱模式下丹參提取物均能降低大鼠心電圖ST 段，能夠改善大鼠的收縮與舒張功能，具有清除氧自由基、抑制氧自由基的產(chǎn)生和過脂質(zhì)化的作用，抑制血清中CK、LDH 活性的升高從而保護(hù)心肌組織。將藥效數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析后，各藥效指標(biāo)結(jié)果都表明不同加熱模式下丹參提取物能改善大鼠心肌缺血的癥狀，但是不同加熱模式之間藥效差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明微波加熱不會改變丹參原有的藥效。

進(jìn)一步通過模糊綜合評判法將藥效指標(biāo)的定性評價轉(zhuǎn)化為定量評價[15-16]，從7 種藥效評分表中可以直觀地看出微波加熱的藥效綜合評分大于傳統(tǒng)加熱的藥效評分，可見微波加熱的藥效強度大于傳統(tǒng)加熱的藥效強度。這與課題組前期研究[17]發(fā)現(xiàn)的微波提取的化學(xué)成分在種類上沒有差異，但是丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮 Ⅱ A 的含量均大于傳統(tǒng)提取的含量的結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

本研究以大鼠急性心肌缺血為藥效模型來考察微波加熱對丹參提取物藥效的影響，結(jié)果表明微波加熱不會改變藥效，并且能夠在一定程度上增加藥效強度。由于本次實驗采用的工藝參數(shù)為傳統(tǒng)加熱的最優(yōu)工藝參數(shù)，提取時間長，傳統(tǒng)加熱與微波加熱的有效成分都提取完全，藥效強度差異較小。建議后續(xù)從提取動力學(xué)角度研究，比較傳統(tǒng)加熱與微波加熱提取動力學(xué)的差異性。本研究為微波提取技術(shù)在中藥大工業(yè)生產(chǎn)以及中藥微波提取物在臨床的廣泛應(yīng)用提供參考。