王慧慧，趙 可，許澤艷，3，彭海恩，梁長虹，劉再毅

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院影像醫(yī)學(xué)與核醫(yī)學(xué)專業(yè)，廣東 汕頭 515041；

2.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）放射科，廣東 廣州 510080；

3.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)，廣東 廣州 510006

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率居全世界惡性腫瘤的第3位，死亡率居全球第2位［1］。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）由錯配修復(fù)基因發(fā)生缺陷所致，在CRC中占比10%～20%［2-3］。與微衛(wèi)星穩(wěn)定性（microsatellite stability，MSS）患者相比，MSI患者能從免疫治療中獲益，且預(yù)后更好。目前，臨床上可通過基于病理組織標(biāo)本的免疫組織化學(xué)方法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及二代測序?qū)RC患者的MSI狀態(tài)進(jìn)行測定，但因其均依賴于有創(chuàng)操作所獲取的組織標(biāo)本，且檢測費(fèi)用較高［4］，MSI狀態(tài)并未在CRC患者中普遍檢測。如果能在術(shù)前通過簡單、無創(chuàng)的方式評估CRC患者M(jìn)SI狀態(tài)，就能對MSI患者進(jìn)行初篩，進(jìn)而協(xié)助指導(dǎo)治療和評估預(yù)后。

術(shù)前影像學(xué)檢查作為CRC診斷和分期的重要檢查方法，在臨床中廣泛應(yīng)用。已有研究［5-10］通過基于計算機(jī)體層成像（computed tomography，CT）或磁共振成像的影像組學(xué)方法來預(yù)測CRC患者的MSI狀態(tài)，但其計算流程較為復(fù)雜，可解釋性欠佳，難以在臨床中實際應(yīng)用。既往基于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H-E）染色切片的相關(guān)研究［11-12］表明，黏液成分、壞死、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞等病理學(xué)指標(biāo)是CRC患者M(jìn)SI的獨(dú)立預(yù)測因子。在增強(qiáng)CT中，腫瘤內(nèi)的低密度區(qū)域以及腫瘤強(qiáng)化特征等可反映腫瘤內(nèi)的黏液、壞死或纖維性成分，其中低密度占比、強(qiáng)化形式及程度等征象已用于結(jié)直腸黏液腺癌的影像學(xué)診斷中［13-14］，但較少研究探究其與CRC患者M(jìn)SI狀態(tài)的關(guān)系。因此，本研究旨在分析術(shù)前增強(qiáng)CT低密度占比以及腫瘤強(qiáng)化等影像學(xué)特征對CRC患者M(jìn)SI的預(yù)測價值。此外，進(jìn)一步探究相關(guān)影像學(xué)特征與CRC患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 資料

回顧并收集2010年3月—2016年3月于廣東省人民醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)檢查確診為CRC的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 術(shù)前均接受腹部或盆腔增強(qiáng)CT檢查；② 均行CRC根治性手術(shù)，且切除組織均通過免疫組織化學(xué)法檢測MSI狀態(tài)。排除標(biāo)準(zhǔn)：① CT檢查前或術(shù)前接受新輔助治療；② CT圖像因偽影或腸道準(zhǔn)備欠佳而影響腫瘤評估；③ 手術(shù)切緣有腫瘤殘余。收集患者的年齡、性別、術(shù)前癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平及MSI狀態(tài)。MSI狀態(tài)檢測方法：通過免疫組織化學(xué)法檢測4種DNA錯配修復(fù)蛋白（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）的表達(dá)情況，來確定是否存在錯配修復(fù)功能缺陷。如果1種或多種蛋白表達(dá)缺失，則會被判定為錯配修復(fù)缺陷（MSI）；如果4種蛋白全部表達(dá)，則判斷為錯配修復(fù)功能正常（MSS）。最后將納入本研究的患者按照1∶1隨機(jī)分配至訓(xùn)練組和驗證組。本研究通過廣東省人民醫(yī)院倫理委員會審批，豁免患者知情同意。

采取門診、住院復(fù)查及電話相結(jié)合的方式進(jìn)行隨訪。術(shù)后第1年每3～6個月隨訪1次，術(shù)后第2年每半年隨訪1次，之后每年隨訪1次。本研究的終點(diǎn)事件為患者因任何原因?qū)е滤劳?。生存時間為從手術(shù)日期開始至發(fā)生終點(diǎn)事件或最后1次隨訪。

1.2 CT檢查方法

檢查前1 d患者進(jìn)半流質(zhì)飲食，禁服含重金屬藥物。檢查前禁食4～6 h。檢查前15 min肌內(nèi)注射解痙藥物鹽酸山莨菪堿20 mg（有禁忌證患者除外），減少腸蠕動偽影。

采用美國GE公司的Lightspeed VCT 64層螺旋CT機(jī)行腹部或盆腔CT平掃及增強(qiáng)掃描。掃描參數(shù)：管電壓120 kV，管電流 250 mA，層厚1.25 mm，準(zhǔn)直器寬度0.625 mm，球管旋轉(zhuǎn)時間0.6 s，螺距0.984，矩陣512×512。增強(qiáng)掃描對比劑為碘普胺（含碘370 mg/mL），經(jīng)肘部靜脈以3.0 mL/s速率團(tuán)注，劑量90～100 mL。分別于對比劑注射30、60 s后獲得動脈期、靜脈期掃描圖像。

1.3 圖像分析

由放射科醫(yī)師A采用盲法閱片并評估影像學(xué)特征。評估內(nèi)容：① 腫瘤位置，分為右半結(jié)腸和左半結(jié)腸或直腸，其中右半結(jié)腸包括升結(jié)腸和右側(cè)2/3橫結(jié)腸，左半結(jié)腸或直腸包括左側(cè)1/3橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和直腸；② 腫瘤內(nèi)低密度占比，根據(jù)低密度范圍在腫瘤內(nèi)的占比分為＜1/3、1/3～2/3和＞2/3；③ 強(qiáng)化程度，根據(jù)腫瘤實性成分與鄰近正常腸壁的強(qiáng)化程度進(jìn)行比較，分為低于、等于和高于正常腸壁；④ 強(qiáng)化形式，分為均勻和不均勻強(qiáng)化；⑤ 腸壁增厚形式，分為局限性和環(huán)形，或向心性和偏心性。放射科醫(yī)師B采用盲法閱片對隨機(jī)選取的30例患者進(jìn)行上述影像學(xué)特征的評估。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用R語言4.0.3版本和SPSS 26.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)變量首先進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布及方差齊性的變量采用t檢驗，不符合正態(tài)分布及方差齊性的變量采用Mann-Whitney U檢驗比較兩組間的差異。分類變量組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗。采用kappa一致性檢驗評價2名放射科醫(yī)師對影像學(xué)特征評估結(jié)果的一致性，kappa值＜0.20為一致性差，0.20≤kappa值＜0.40為一致性一般，0.40≤kappa值＜0.60為一致性中等，0.60≤kappa值＜0.80為一致性較高，kappa值≥0.80為一致性極高。

采用logistic回歸方程對MSI的可能相關(guān)特征進(jìn)行單因素分析，將P＜0.05的特征使用前進(jìn)法納入多因素分析中。使用訓(xùn)練組多因素分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義的特征構(gòu)建CRC患者的MSI預(yù)測模型，并在驗證組中進(jìn)行驗證。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線及曲線下面積（area under curve，AUC）評估模型與變量的預(yù)測效能。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，使用Log-rank檢驗比較不同低密度占比組生存率的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者資料

納入本研究的3 8 2例患者中，男性231例，女性151例，年齡25～90歲，平均年齡（62.9±11.7）歲，MSI患者40例（10.5%）。腫瘤位置在右半結(jié)腸的患者108例（28.3%），腫瘤內(nèi)低密度占比1/3～2/3和＞2/3的患者分別為24例（6.3%）、38例（9.9%），腸壁環(huán)形增厚的患者308例（80.6%），腸壁偏心性增厚的患者76例（19.9%），腫瘤強(qiáng)化低于腸壁和高于腸壁的患者分別為70例（18.3%）、75例（19.6%），腫瘤強(qiáng)化不均勻的患者163例（42.7%）。訓(xùn)練組和驗證組均為191例，在訓(xùn)練組和驗證組中MSI患者分別為19例（9.9%）和21例（11.0%）。在訓(xùn)練組和驗證組中，除了CEA外，患者的年齡、性別、腫瘤位置、低密度占比等的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 訓(xùn)練組和驗證組患者的臨床及CT特征 n（%）

2.2 MSI狀態(tài)的增強(qiáng)CT特征分布

在訓(xùn)練組中，CRC患者M(jìn)SI多見于右半結(jié)腸、低密度占比＞2/3、腫瘤強(qiáng)化低于腸壁和強(qiáng)化不均勻。右半結(jié)腸中MSI患者12例（21.4%），左半結(jié)腸或直腸中MSI患者7例（5.2%）；低密度占比＞2/3中MSI患者6例（37.5%），在低密度占比1/3～2/3和＜1/3中MSI患者分別為3例（33.3%）、10例（6.0%）；腫瘤強(qiáng)化低于、等于、高于腸壁中的MSI患者分別為8例（6.7%）、8例（25.8%）、3例（7.5%）；強(qiáng)化不均勻中MSI患者14例（18.2%），而在強(qiáng)化均勻中MSI患者只有5例（4.4%）。在驗證組中可以發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果。

2.3 臨床及增強(qiáng)CT影像學(xué)特征與MSI單因素及多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，在訓(xùn)練組和驗證組中，腫瘤位置、低密度占比、強(qiáng)化程度以及強(qiáng)化形式在MSI和MSS組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。年齡、性別、術(shù)前CEA及腸壁增厚形式在MSI和MSS組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。在訓(xùn)練集中，將差異有統(tǒng)計學(xué)意義的特征（腫瘤位置、低密度占比、強(qiáng)化程度以及強(qiáng)化形式）納入多因素分析中。結(jié)果顯示，腫瘤位置（左半結(jié)腸或直腸組vs右半結(jié)腸組，OR值0.20，95%CI 0.07～0.54，P=0.002）和低密度占比（低密度占比＞2/3組vs低密度占比＜1/3組，OR值9.36，95% CI 2.83～31.0，P＜0.001）是CRC患者M(jìn)SI的獨(dú)立預(yù)測因子（表3）。在驗證集中發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果。圖1為低密度占比的示例。

圖1 CRC低密度占比示例

表2 訓(xùn)練組和驗證組結(jié)直腸癌MSI的單因素logistic回歸分析

表3 訓(xùn)練組和驗證組結(jié)直腸癌MSI的多因素logistic回歸分析

一致性分析結(jié)果顯示，在各影像學(xué)特征中，醫(yī)師A和醫(yī)師B對于腫瘤位置和腫瘤邊界的評估結(jié)果一致性極高（kappa值均為1.000），低密度占比的評估結(jié)果一致性較高（kappa值為0.724，95% CI 0.481～0.967），其余影像學(xué)特征評估結(jié)果的一致性差、一般或中等（kappa值為0.164～0.444）。

2.4 MSI預(yù)測模型評估

本研究結(jié)合腫瘤位置和低密度占比構(gòu)建的模型對MSI有較好的預(yù)測效能，比單一指標(biāo)的預(yù)測效能更優(yōu)（圖2A、B）。在CRC患者中，腫瘤位置在訓(xùn)練組中預(yù)測效能的AUC為0.69（95% CI 0.57～0.80），準(zhǔn)確度為73.3%，靈敏度為63.2%，特異度為74.4%；在驗證組中的AUC為0.72（95%CI 0.62～0.83），準(zhǔn)確度為75.9%，靈敏度為66.7%，特異度為77.6%。低密度占比在訓(xùn)練組中預(yù)測效能的AUC為0.69（95% CI 0.58～0.81），準(zhǔn)確度為86.4%，靈敏度為47.4%，特異度為90.7%；在驗證組中的AUC為0.72（95% CI 0.61～0.83），準(zhǔn)確度為82.2%，靈敏度為57.1%，特異度為85.3%。與單一特征相比，結(jié)合腫瘤位置和低密度占比構(gòu)建的模型在訓(xùn)練組和驗證組中預(yù)測效能均有提高，在訓(xùn)練組中預(yù)測效能的AUC為0.80（95% CI 0.70～0.90），準(zhǔn)確度為70.7%，靈敏度為84.2%，特異度為69.2%；在驗證組中的AUC為0.75（95% CI 0.63～0.87），準(zhǔn)確度為87.4%，靈敏度為57.1%，特異度為91.2%。

2.5 預(yù)后分析

由于低密度占比1/3～2/3和＞2/3患者數(shù)相對較少，將兩者合并歸類為低密度占比-高；而將低密度占比＜1/3歸類為低密度占比-低。在完整數(shù)據(jù)集組中，低密度占比-低組的5年生存率（76.0%）略高于低密度占比-高組的5年生存率（66.0%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.110，圖2C）。在左半結(jié)腸或直腸組中，低密度占比-低組和低密度占比-高組的患者5年生存率分別為75.7%、56.2%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004，圖2D）。在右半結(jié)腸組中，低密度占比-低組和低密度占比-高組的患者5年生存率分別為76.8%、71.7%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.910，圖2E）。

圖2 特征對CRC MSI的預(yù)測效能以及對患者生存率的影響

3 討 論

MSI狀態(tài)檢測對CRC患者治療方案的選擇和預(yù)后判斷至關(guān)重要。目前臨床使用的MSI狀態(tài)檢測方法是對腫瘤組織標(biāo)本通過免疫組織化學(xué)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或二代測序進(jìn)行檢測，然而其檢測費(fèi)用高，而且并非每例CRC患者都適宜獲取腫瘤的組織標(biāo)本。在最新的CRC診療指南中，推薦將增強(qiáng)CT檢查作為術(shù)前診斷及分期優(yōu)先選擇的一項檢查方式。本研究選取增強(qiáng)CT檢查作為圖像評價基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)CT圖像中獲取的腫瘤位置和低密度占比與CRC患者的MSI狀態(tài)相關(guān)。

既往研究表明H-E染色切片相關(guān)特征可以預(yù)測CRC患者的MSI狀態(tài)。Yamashita等［15］基于H-E染色切片建立深度學(xué)習(xí)模型對MSI狀態(tài)進(jìn)行預(yù)測，達(dá)到了較好的預(yù)測效果，驗證組中AUC為0.779～0.964。但深度學(xué)習(xí)模型較為復(fù)雜，可解釋性較差。Greenson等［11］在H-E染色切片的主觀病理學(xué)特征評估中發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)壞死、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞及黏液成分等與MSI相關(guān)。但H-E染色切片的標(biāo)本需通過有創(chuàng)方式獲取，仍未能實現(xiàn)術(shù)前評估MSI狀態(tài)。

影像學(xué)特征已用于評估MSI狀態(tài)?；贑T或磁共振成像的手工特征或深度學(xué)習(xí)特征的影像組學(xué)方法可以對CRC患者的MSI狀態(tài)進(jìn)行預(yù)測，AUC為0.688～0.961［5-10］。影像組學(xué)方法可以在術(shù)前評估MSI狀態(tài)，但其較為復(fù)雜，且多數(shù)納入的影像學(xué)特征的可解釋性尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)CT腫瘤內(nèi)低密度占比與CRC患者的MSI狀態(tài)相關(guān)。在單因素分析中，低密度占比、增強(qiáng)程度及增強(qiáng)形式在MSI和MSS組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，但在多因素分析中，三者中只有低密度占比為獨(dú)立預(yù)測因子，可能是因為三者在增強(qiáng)CT圖像中均與組織的密度相關(guān)，即存在線性關(guān)系所致。增強(qiáng)CT腫瘤內(nèi)的低密度區(qū)域可反映上述H-E染色切片中的黏液成分及壞死組織。腫瘤位置也是MSI的獨(dú)立預(yù)測因子，這與既往研究［11］結(jié)果相一致。腫瘤位置結(jié)合低密度占比預(yù)測MSI的AUC達(dá)到0.80。

本研究結(jié)果顯示，發(fā)生在左半結(jié)腸、低密度占比-低組的患者預(yù)后較好。左半結(jié)腸或直腸組中，低密度占比-低組的患者5年生存率為75.7%。增強(qiáng)CT腫瘤內(nèi)的低密度區(qū)域可反映黏液成分、壞死組織或纖維性成分。黏液成分與CRC預(yù)后的關(guān)系尚有爭議，有些研究［16-17］表明黏液成分提示預(yù)后不佳，但有些研究［18-20］表明黏液成分與預(yù)后無關(guān)。壞死是實性腫瘤一個常見的特征，多是由于腫瘤快速生長缺乏足夠的血供，導(dǎo)致微環(huán)境缺氧進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞死亡，往往提示預(yù)后不佳［21］。腫瘤發(fā)生在右半結(jié)腸時，低密度占比與預(yù)后無關(guān)，這可能與本研究納入患者腫瘤位置在左半結(jié)腸者居多有關(guān)。

本研究存在一定的局限性。首先，本文僅納入了部分影像學(xué)特征，可能遺漏其他與MSI相關(guān)的特征。但本研究納入的影像學(xué)特征較易評估，且可解釋性較強(qiáng)。其次，本研究中增強(qiáng)CT圖像中的低密度占比為放射科醫(yī)師主觀評估結(jié)果，與放射科醫(yī)師的經(jīng)驗有關(guān)。在今后的研究中將對腫瘤內(nèi)低密度占比進(jìn)行人工智能精準(zhǔn)量化以提高結(jié)果的一致性。最后，本組資料為單中心的回顧性分析，可能會存在一定的選擇偏倚。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)CT圖像中腫瘤的低密度占比是CRC患者M(jìn)SI狀態(tài)的獨(dú)立預(yù)測因子，低密度占比與腫瘤位置相結(jié)合可預(yù)測MSI狀態(tài)。術(shù)前增強(qiáng)CT圖像中的上述指標(biāo)有助于對CRC患者進(jìn)行MSI的初篩。