吳耀棠，梁健鵬，林思嫻，劉宏梽，向 斌，丁 鏟，徐成剛，廖 明，任 濤

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

新城疫（newcastle disease, ND）具有高致病性、高死亡率，是一種由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起禽類發(fā)病、致死的急性、高度接觸性傳染病[1]。NDV屬于禽副黏病毒1型（APMV-1）[2]，發(fā)病時主要以呼吸道、消化道黏膜出血為主。基因Ⅶ型毒株是我國目前新城疫病毒的流行株，Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ等其他基因型株在一些地區(qū)呈現(xiàn)零星散發(fā)[3]，在我國，廣東、江蘇兩省的許多鵝群、鴨群陸續(xù)有NDV感染并造成嚴(yán)重的發(fā)病、死亡，有些表現(xiàn)帶毒呈隱性感染[4]，直至目前仍然沒有有效的藥物對新城疫進(jìn)行治療，種種現(xiàn)象表明該病仍然是最危險的禽病之一[5]。誘導(dǎo)高水平的黏膜免疫在感染早期、初始部位徹底清除病原體對于動物機(jī)體的免疫十分重要。納米顆粒藥物傳遞系統(tǒng)可以控制和維持藥物在定位部位的釋放[6]，優(yōu)勢在于靶向性以及納米顆粒包封的藥物在疾病部位的有效性[7]。殼聚糖是一種安全可靠的堿性天然生物活性多糖，其來源豐富、生物相容性好、可降解和分解產(chǎn)物無毒[8-9]，并且其粒徑小，表面積大，與生物膜有較高的黏著性等優(yōu)點，已成為廣泛應(yīng)用的新型藥用輔料之一，作為微球、微囊、納米顆粒等藥物載體的研究也日益受到重視[10]。國內(nèi)外很少有家禽病毒制備納米顆粒疫苗研究的報道，本試驗以殼聚糖為載體，TPP和MgSO4為交聯(lián)劑，采用離子交聯(lián)法，制備DNA納米顆粒疫苗，優(yōu)化制備途徑，制備出粒徑小、分散性好的納米顆粒，使其在機(jī)體內(nèi)緩慢釋放，解決了黏膜免疫部位的IgA抗體低和疫苗利用度低的問題，為家禽新型DNA疫苗的研制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與雞胚 9～11日齡SPF雞胚和2周齡SPF雞，均為廣東省新興大華農(nóng)禽蛋有限公司產(chǎn)品，試驗期間SPF雞飼養(yǎng)于禽病感染實驗室的負(fù)壓隔離器中。

1.2 試驗毒株、細(xì)胞、抗體及載體 新城疫病毒rGM毒株、pCAGGS表達(dá)載體、DF-1細(xì)胞和DH5α感受態(tài)細(xì)胞為本試驗室保存；兔抗雞新城疫F多克隆抗體由本實驗室制備。

1.3 主要試劑及儀器 殼聚糖（脫乙酰度≥85%，低分子質(zhì)量級），三聚磷酸鈉購自Sigma；限制性內(nèi)切酶NheⅠ和EcoRⅠ、DNA Marker購自TaKaRa公司產(chǎn)；E.Z.N.A Endo-free Plasmid DNA Mini Kit Ⅱ購自O(shè)MEGA公司；超聲波細(xì)胞破碎儀為南京先歐儀器制備有限公司；Master cycler Personal PCR儀購自德國Eppendorf公司；納米粒度分布儀BT-90購自丹東百特儀器有限公司；JS94H型微電泳儀購自上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司。

1.4 rGM的繁殖及EID50采用參考文獻(xiàn)[3]的方法，對rGM毒株進(jìn)行繁殖培養(yǎng)、純化及EID50的測定。

1.5 F基因cDNA的獲取 以提取的NDV rGM株RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20 μL）為：RNA提取液12.5 μL，5× MLV Buffer 4.0 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，dNTPs 1.0 μL，RNase 抑制劑 0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄引物R:O 1.0 μL。置于42℃水浴鍋水浴1 h，將所得反應(yīng)產(chǎn)物cDNA用于PCR擴(kuò)增。

1.6 PCR產(chǎn)物的克隆與pCAGGS-F的構(gòu)建 取上述的cDNA用于擴(kuò)增F基因，反應(yīng)體系（50 μL）：Premix Ex Taq 25 μL，cDNA模板2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL， ddH2O 21.5 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸100 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min，4℃保存，PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。用常規(guī)方法將F片段克隆至pMD19-T載體上，命名為pMD19-T-F。用EcoRⅠ和NheⅠ雙酶切pCAGGS與pMD19-T-F得到大小1700 bp的F片段和pCAGGS載體的線性片段，然后用T4 DNA連接酶連接，得pCAGGS-F。將連接產(chǎn)物加入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于氨芐抗性的LB平板上，篩選陽性克隆，挑單菌落，對送測序鑒定的菌液進(jìn)行過夜培養(yǎng)，質(zhì)粒抽提。以上所用引物為：rGM-F-F：5'-CGGAATTCGCCACCATGGGCTTCAAACCTTC TACC-3'；rGM-F-R：5'-CGGCTAGCTCATGCTC TTGTAGTGGCTCT-3'。

1.7 重組質(zhì)粒pCAGGS-F鑒定 酶切反應(yīng)體系（50 μL）為：10× Buffer 5 μL，重組質(zhì)粒pCAGGS-F2μL，EcoRⅠ酶1 μL，NheⅠ酶1 μL，ddH2O 41 μL。在37℃水浴鍋中酶切20 min后，于1%凝膠電泳觀察結(jié)果。將DF-1細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于6孔板中生長，置于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染步驟按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進(jìn)行，將pCAGGS-F轉(zhuǎn)染24 h后，進(jìn)行間接免疫熒光鑒定。

1.8 DNA納米顆粒疫苗制備 在50 mL錐形瓶中加入5 mL不同濃度（0.5 ～2 mg/mL）的殼聚糖溶液，600 rpm攪拌5 min；往錐形瓶四周緩慢滴加2 mL不同濃度（100 ng/μL～1 000 ng/μL）pCAGGS-F質(zhì)粒溶液，攪拌3 min；將攪拌速度調(diào)至700～1 000 rpm，攪拌3 min；繼續(xù)滴加1 mL不同濃度（0.5 mg/mL～2 mg/mL）MgSO4溶液和2 mL不同濃度（0.5 mg/mL～2 mg/mL）TPP溶液，在1000 rpm，磁力攪拌下往錐形瓶四周緩慢滴加，并保持在10 min滴完，此時溶液會出現(xiàn)一種淡藍(lán)色乳光；；離心后棄上清液，用無菌ddH2O洗滌沉淀，超聲破碎直到沉淀溶解，真空冷凍干燥得DNA納米顆粒疫苗固體粉末，測定包封率，Zeta電位，篩選最優(yōu)條件，并考察其穩(wěn)定性。

1.9 免疫效果分析 取50只2周齡SPF雞，共分為5組，每組10只。試驗組Ⅰ：對照組，每只后腿肌肉多點注射200 μL PBS溶液；試驗組Ⅱ：每只點眼滴鼻免疫200 μL殼聚糖-TPP溶液；試驗組Ⅲ：每只后腿肌肉多點注射200 μL（100 μg）pCAGGS-F質(zhì)粒；試驗組Ⅳ：每只于后腿多點肌肉注射200 μL，含100 μg DNA的納米顆粒溶液；試驗組Ⅴ：每只點眼滴鼻免疫200 μL（100 μg）DNA的納米顆粒溶液；所有組在一免后兩周，以相同劑量加強(qiáng)免疫一次。二免后兩周每組雞通過點眼滴鼻接種100 μL 103EID50新城疫rGM病毒，連續(xù)觀察14 d，記錄所有雞的臨床情況，統(tǒng)計死亡雞、發(fā)病雞的情況。在攻毒后的第3、5、7、9 d和11 d采集咽和泄殖腔拭子，檢測排毒情況。試驗組的病死雞立即解剖，觀察病變，拍照留存，做好記錄。

2 結(jié)果

2.1 EID50的測定 EID50為107.26/0.1 mL，即將病毒懸液做10-7.26倍稀釋后，給每枚雞胚接種0.1 mL，可以使50%的雞胚感染。

2.2 pCAGGS-F重組質(zhì)粒的構(gòu)建 NDV F基因的菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后可見一條約1700 bp的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。重組表達(dá)載體進(jìn)行質(zhì)粒抽提后，用NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，可見2條約為4800 bp和1700 bp目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。IFA結(jié)果顯示，陰性對照觀察不到特異性熒光，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCAGGS-F的DF-1細(xì)胞可觀察到特異性熒光，說明構(gòu)建的質(zhì)粒pCAGGS-F、pCAGGS-F/Nps可表達(dá)特異性的蛋白。

圖1 新城疫病毒F基因的菌液PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of F gene of Newcastle disease virus

圖2 pCAGGS-F的酶切鑒定Fig.2 Identification of pCAGGS-F by restriction enzyme digestion

2.3 優(yōu)化條件篩選 固定其他因數(shù)不變，基于殼聚糖本身的特性，在pH4.5～6.5的范圍內(nèi)探討制備出的納米顆粒（見表1）。優(yōu)化條件結(jié)果為pH6.0，殼聚糖濃度1.0 mg/mL，體積為5 mL；質(zhì)粒濃度500 ng/μL，體積為2 mL；MgSO4濃度為1 mg/mL，體積為1 mL；TPP濃度1 mg/mL，體積為2 mL，整體質(zhì)量比殼聚糖：MgSO4：TPP：DNA為5∶1∶2∶1時，包封率可達(dá)到一個較高的值，高于90%（見圖4）。在納米粒度分析中，多分散性PDI較小，呈較穩(wěn)定的狀態(tài)。儲存穩(wěn)定性分析結(jié)果凍干組與4℃納米顆粒溶液組的平均粒徑與PDI沒有發(fā)生明顯的變化，比較穩(wěn)定（見圖5）。

表1 納米顆粒的粒徑、Zeta電位及PDITable 1 Particle size, Zeta potential and PDI of Nanoparticles

圖3 間接免疫熒光結(jié)果Fig.3 Indirect immuno fluorescence results

圖4 不同因素對納米顆粒包封率的影響Fig.4 Effects of different factors on encapsulation efficiency of nanoparticles

圖5 納米顆粒的粒徑、PDI隨時間的變化（n=3）Fig.5 Changes of particle size and PDI with time (n=3)

2.4 免疫效果分析 在一免28 d后的DNA納米顆粒點眼滴鼻免疫組（Intraocular-nasal immunity, i.n）免疫的雞有較高的IgG水平，抗體滴度都顯著高于其他組（見圖7）。在IgA的檢測中，DNA納米顆粒肌肉注射免疫組（Intramuscular immunity, i.m）檢測到IgA的含量有一定的增加，淚液、氣管液、膽汁及血清中IgA的動態(tài)增長曲線也相似，在一免后第14 d達(dá)到一個小高峰，第28 d達(dá)到最高峰，都顯著高于其他免疫組，說明了該組可以誘導(dǎo)更快、更好的黏膜免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的IgA抗體可以起到抗病毒作用。新城疫rGM毒株以100 μL 103EID50劑量通過點眼滴鼻途徑感染試驗雞（見圖8），PBS組與殼聚糖-TPP組的死亡率為100%，攻毒rGM后腺胃乳頭出血嚴(yán)重，病死雞具有ND的典型病理變化（見圖9），而DNA納米顆粒疫苗點眼滴鼻組的保護(hù)率要高于pCAGGS-F組，為100%，其排毒情況見表2。

表2 拭子檢測排毒情況Table 2 Detoxification by swab test

圖6 免疫雞IgA抗體的測定（n=3）Fig.6 Detection of IgA Antibody in Immunized Chickens (n=3)

圖7 免疫雞中和抗體水平變化Fig.7 Changes of neutralizing antibody level in immunized chickens

圖8 攻毒保護(hù)試驗存活率Fig.8 Survival rate of attack and protection test

圖9 肌胃腺胃解剖圖Fig.9 Muscle-stomach glandular-stomach anatomy

3 討論

ND是由NDV引起禽類發(fā)病、致死的急性、高度接觸性傳染病，迄今為止NDV感染的禽類已超過250多種，給整個養(yǎng)禽行業(yè)帶來嚴(yán)重影響。我國目前NDV流行株為基因Ⅶ型毒株，尤其是Ⅶd亞型毒株的流行給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而市場上常用的ND疫苗株是由基因Ⅱ型毒株分離而來的，而劉秀梵等[11]研究證明，該基因Ⅱ型毒株與Ⅶ型毒株基因組的同源性只有82%左右，對黏膜有特殊的親嗜性，通過呼吸道和消化道侵入機(jī)體[12]。為了提高更好的免疫保護(hù)效力，開發(fā)新城疫基因Ⅶ型的新疫苗具有非常廣闊的應(yīng)用前景。動物機(jī)體的呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道等黏膜表面集中了大量的免疫細(xì)胞、淋巴組織等，構(gòu)成了有機(jī)體抵御病原微生物的第一道免疫屏障，誘導(dǎo)高水平的黏膜免疫在感染早期、初始部位徹底清除病原體對于動物機(jī)體的免疫十分重要。鼻黏膜免疫是一個安全有效、操作方便的免疫途徑，鄭冬梅[13]通過對La Sota弱毒苗免疫后雛雞黏膜免疫系統(tǒng)中IgA的消長規(guī)律進(jìn)行研究，證明了鼻黏膜免疫途徑產(chǎn)生的IgA量均高于其他免疫途徑途徑，能有效地刺激鼻黏膜局部分泌特異性IgA、IgG，引起廣泛的黏膜免疫反應(yīng)，對清除病毒及細(xì)胞內(nèi)及寄生物有很大的作用。

溶液的pH、殼聚糖濃度、MgSO4濃度、TPP濃度等都會影響到納米顆粒的穩(wěn)定性、粒徑、包封率，從而影響納米顆粒疫苗效果[14]。免疫實驗中，納米顆粒疫苗組具有較高的IgG、IgA水平。在攻毒保護(hù)試驗中，DNA納米顆粒疫苗點眼滴鼻組具有100%的保護(hù)率，具有良好的保護(hù)效果，結(jié)果表明該疫苗對新城疫的防治具有一定的應(yīng)用價值。另外，本試驗初步探討新城疫新型疫苗的應(yīng)用，為相關(guān)新城疫新疫苗的開發(fā)提供了一些新思路。