包松英，莊許諾，江興華，王全溪

（1.兆豐華生物科技（福州）有限公司，福州 350014；2.福建農(nóng)林大學(xué) 福建省獸醫(yī)中藥與動物保健重點實驗室，福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué) 中西獸醫(yī)結(jié)合與動物保健福建省高等學(xué)校重點實驗室，福州 350002）

豬瘟是一種由豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引發(fā)的接觸性傳染病，臨床特點為高熱、出血，并伴隨高死亡率，嚴重危害了養(yǎng)豬業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。近年來，在亞洲、南美、中美洲及加勒比地區(qū)近年來，在亞洲、南美、中美洲及加勒比地區(qū)CSFV仍然流行。自2015年起被正式指定為無豬瘟疫情的日本，于2018年在家豬和野豬中暴發(fā)豬瘟疫情[1-2]。目前，我國豬瘟疫病流行特點為：中小豬場零星散發(fā)，野生型豬瘟的毒力降低，病程從急性和亞急性轉(zhuǎn)向慢性發(fā)展，多種病原混合感染。疫苗免疫仍是控制豬瘟的主要手段[3]。20世紀50年代，我國科學(xué)家經(jīng)兔體傳350多代后獲得了安全、免疫原性好的優(yōu)勢豬瘟疫苗株——C株，C株弱毒疫苗的大范圍推廣應(yīng)用，對于我國豬瘟防控起到了至關(guān)重要的作用，且在現(xiàn)階段流行毒株復(fù)雜的形勢下，C株疫苗仍安全有效[4-5]。豬瘟活疫苗（兔源）又叫豬瘟脾淋苗，是C株接種健康家兔，收獲出現(xiàn)定型熱兔體的脾臟和腸系膜淋巴結(jié)研磨制備而成的疫苗，良好保留了病毒免疫原性，免疫豬體后快速產(chǎn)生保護力，且副反應(yīng)小，可有效控制臨床常見的慢性、溫和型豬瘟以及非典型豬瘟[6]。

RNA-seq是目前應(yīng)用最多也是最成熟的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，大范圍應(yīng)用于臨床研究。RNA-seq技術(shù)通過統(tǒng)計細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)表達量數(shù)據(jù)，研究生命體某個過程的作用機理，重要基因的表達模式與調(diào)控機制等[7]。在獸醫(yī)領(lǐng)域，該技術(shù)已應(yīng)用于破譯基因組結(jié)構(gòu)與功能，揭示病原體致病機理以及遺傳育種[8-10]等方面。

目前，已有針對豬瘟兔化弱毒株感染家兔后不同時間段，兔體對病毒的免疫反應(yīng)研究[11-12]，而豬瘟脾淋苗對豬體的免疫機理研究尚少。本文通過對豬體免疫豬瘟脾淋苗，以脾淋組織作為對照，采集免疫后第3 d的血液樣本，進行RNA-seq測序分析，以期研究脾淋苗接種早期機體的免疫應(yīng)答，為了解疫苗免疫機理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與免疫物 4周齡小豬10頭，購自福州市永泰縣某豬場，試驗豬未普免，經(jīng)檢測為非洲豬瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）、口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2,PCV-2）8種病原陰性以及豬瘟抗體陰性的健康小豬。豬瘟脾淋苗、健康家兔脾淋組織由兆豐華生物科技（福州）有限公司提供。

1.2 試劑 總RNA提取試劑盒購自蘭博利德試劑有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司；實時熒光定量PCR試劑盒購自蘭博利德試劑有限公司。

1.3 分組 將10頭小豬隨機分為A、B兩組，每組5頭，其中A組肌肉注射豬瘟脾淋苗1頭份，B組肌注等量健康家兔脾淋組織。

1.4 樣品采集 采集免疫后第3 d的豬前腔靜脈血液樣本，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測序與數(shù)據(jù)分析 提取樣品總RNA，精確檢測完整性和總量后，構(gòu)建合格文庫，以Illumina HiSeq 2500測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾、錯誤率檢查、GC含量檢查后，獲得clean data。使用HISAT2 v2.0.5將數(shù)據(jù)與豬參考基因組進行比對，采用featureCounts進行基因表達水平定量，使用DESeq2軟件進行差異表達分析，其中P＜0.05，|log2FoldChange|≥0的基因為差異表達基因。以clusterProfiler軟件實現(xiàn)差異表達基因的GO富集分析，與KEGG通路中差異表達基因的統(tǒng)計富集，使用本地版GSEA分析工具對樣品功能注釋與富集分析。

1.6 RT-qPCR驗證 選擇4個基因，按照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄體系為：25mmol/L MgCl22 μL，GoScript?Reverse Transcriptase 1 μL，GoScript?5× Reaction Buffer 4 μL，Recombinant RNasin?Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，Oligo(dT)15 Primer 1 μL，Random Primers 1 μL，PCR Nucleotide Mix 10mmol/L 1 μL，Nuclease-Free水補足至20 μL。于42℃反應(yīng)15 min，72℃反應(yīng)15 min獲得cDNA，cDNA進行RT-qPCR檢測。β-actin：正向引物為5′-CCAGCCA TGTATGTAGCCATCCAG-3′，反向引物為5′-ACGGCCAGCCAGATCCAGAC-3′，產(chǎn)物大?。?66 bp；CXCL10：正向引物為5′-TGCCCACATG TTGAGATCATTGCC-3′，反向引物為5′-TTGATG GCCTTCGACTCTGGATTC-3′，產(chǎn)物大?。?0 bp；NOS3：正向引物為5′-CAGGGTGGAAGCGGTA ACAAAGG-3′，反向引物為5′-CTGCTTGGCGGC GAAGATGAG-3′，產(chǎn)物大?。?5 bp；CD86：正向引物為5′-CTTTGTGATGGTCCTCCTGCTCTC-3′，反向引物為5′-CACGGCAGTTCTCCAGTCT CATTG-3′，產(chǎn)物大?。?1 bp；NOD1：正向引物為5′-ACTTGCTGCACAACGACTACTTCTC-3′，反向引物為5′-ACGAAGAACTCCGACACCTCCTC-3′，產(chǎn)物大小為133 bp。

RT-qPCR循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共45個循環(huán)。以2^ΔΔCT法計算差異表達水平，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計 通過測序獲得的脾淋苗免疫組（A組）與脾淋組織對照組（B組）的原始數(shù)據(jù)如表1。各樣本凈堿基數(shù)均超過6 GB，凈讀數(shù)的Q20百分比>97%，Q30百分比>93%，GC比例>50%。將處理的數(shù)據(jù)比對至豬類參考基因組，總比對率>96%。

表1 測序質(zhì)量以及與參考基因組比對情況Table1 Sequencing quality and comparison with reference genomes

2.2 差異基因篩選 免疫后第3 d，豬瘟脾淋苗組（A組）與脾淋組織對照組（B組）比較，差異表達基因（P＜0.05）有317個，其中上調(diào)表達基因221個，下調(diào)表達基因96個（圖1）。

圖1 差異表達基因火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes

2.3 GO功能富集分析 GO分析主要包括三個維度：生物過程（Biological Process, BP）、細胞組分（Cellular Component, CC）、分子功能（Molecular Function, MF）。通過clusterProfiler（3.4.4）軟件進行差異表達基因GO富集分析，結(jié)果顯示：免后3 d，與BP相關(guān)的有483個，與CC相關(guān)的有98個，與MF相關(guān)的有87個。其中豬瘟脾淋苗組（A組）相對于脾淋組織對照組（B組）組顯著差異轉(zhuǎn)錄的mRNA主要參與BP中的對病毒的防御反應(yīng)（defense response to virus）、病毒過程（viral process）、多種生物細胞過程（multiorganism cellular process）、對其他生物體的防御反應(yīng)（defense response to other organism）、共生，包括通過寄生的互利共生（symbiosis, encompassing mutualism through parasitism）、物種間的相互作用（interspecies interaction between organisms）、對病毒的反應(yīng)（response to virus）7個生物過程（Q＜0.05）（圖2）。

圖2 GO功能富集結(jié)果Fig.2 GO function enrichment analysis results

2.4 KEGG pathway分析 通過clusterProfiler軟件實現(xiàn)KEGG通路中差異表達基因的統(tǒng)計富集發(fā)現(xiàn)，免疫后3 d，被注釋的差異基因數(shù)量為494個，涉及的pathway數(shù)量有215個，與免疫和抗炎相關(guān)的有甲型流感信號通路（Influenza A）、EB病毒感染通路（Epstein-Barr virus infection）、RIG-I樣受體信號通路（RIG-I-like receptor signaling pathway）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）和NOD-like受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）等，其中CXCL10、RSAD2、OAS1、OAS2、MX1、ISG15等基因上調(diào)表達。分析結(jié)果見表2。

表2 差異基因KEGG通路分析結(jié)果Table2 KEGG pathway analysis results of differential genes

2.5 RT-qPCR驗證結(jié)果 為了證實轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性，本試驗隨機篩選了CXCL10、NOS3、CD86、NOD14個差異表達基因進行RT-qPCR驗證。結(jié)果顯示RT-qPCR和RNA-seq測序數(shù)據(jù)之間差異表達基因趨向基本一致（圖3）。

圖3 RT-qPCR與RNA-seq分析差異基因倍數(shù)對比Fig.3 Comparison of differential gene multiples by RT-qPCR and RNA-seq analysis

3 討論

豬瘟脾淋苗以豬瘟兔化弱毒C株接種健康家兔，收獲產(chǎn)生定型熱的兔脾臟、腸系膜淋巴結(jié)制備而成，其中脾淋組織具有免疫增強作用，與活疫苗搭配使用可增強免疫效果[13]。郭海勇等[14-15]采集了免疫豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗的豬脾臟，制備豬脾轉(zhuǎn)移因子，再與豬繁殖與呼吸綜合征疫苗聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)脾轉(zhuǎn)移因子可顯著提升巨噬細胞的吞噬功能以及淋巴細胞的增殖活性。而C株具有良好的免疫原性，C株活疫苗在免疫豬體5 d后，即可抵御豬瘟強毒攻擊，采集接種疫苗的豬扁桃體樣本進行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)一組受調(diào)控的基因，其中許多與ISG15抗病毒途徑有關(guān)，表明其可能與C株疫苗接種早期提供的免疫保護有關(guān)[16]。

本文將豬瘟脾淋苗免疫斷奶仔豬，采集免疫后第3 d的血液樣本，進行RNA-seq測序分析，發(fā)現(xiàn)豬瘟脾淋苗免疫組與脾淋組織對照組對比，差異表達基因數(shù)量達317個（P＜0.05），其中上調(diào)221個，下調(diào)96個；差異基因作GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，顯著差異轉(zhuǎn)錄的mRNA主要參與對病毒的防御反應(yīng)（defense response to virus）、病毒過程（viral process）等生物過程；KEGG信號通路富集分析表明，涉及的pathway數(shù)量有215個，與免疫和抗炎相關(guān)的有甲型流感信號通路、EB病毒感染通路、RIG-I樣受體信號通路、TNF信號通路和NOD-like受體信號通路等。

本研究發(fā)現(xiàn)脾淋苗免疫組中干擾素刺激基因15（IFN-stimulated gene 15, ISG15）顯著上調(diào)表達，與McCarthy等[16]研究結(jié)果相一致。同時，試驗中發(fā)現(xiàn)，CXCL10、RSAD2、OAS1、OAS2、MX1等基因出現(xiàn)顯著上調(diào)表達。CXCL10又叫干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10，是一種趨化因子，功能是募集白細胞，其對白細胞穩(wěn)態(tài)以及調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng)至關(guān)重要。OAS1、OAS2屬于2'-5'-寡腺苷酸合成酶（2'-5'-oligoadenylate synthetase, OAS）基因家族，可在干擾素誘導(dǎo)下產(chǎn)生抗病毒蛋白[17]，活化的OAS利用ATP合成2'-5'-寡腺苷，結(jié)合并激活細胞中潛在的內(nèi)源性核酸酶，參與腦心肌炎病毒、呼腸孤病毒、黃病毒科多種病毒相關(guān)的先天性免疫應(yīng)答[18]。而Wang等[19]利用一種表達海腎熒光素酶標(biāo)記的報告病毒，結(jié)合21種靶向CSFV ISGs的小干擾RNA（siRNA），篩選抗CSFV ISGs，結(jié)果鑒定出4種新型抗CSFV ISGs，其中兩種為CXCL10和OAS1。RSAD2為S-腺苷甲硫氨酸基區(qū)域蛋白2，是Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白[20]，MX1是黏病毒抗性蛋白1，具有抵抗粘液病毒的作用，劉存[21]發(fā)現(xiàn)，牛Mx1蛋白對BVDV在MDBK細胞中的復(fù)制具有抑制作用。

本研究中發(fā)現(xiàn)脾淋苗組相對于脾淋組織免疫組，CXCL10、RSAD2、OAS1、OAS2、MX1、ISG15等基因顯著上調(diào)表達，提示脾淋苗可能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生干擾素，從而刺激宿主先天性免疫反應(yīng)。