張 亞，段佳蕾，劉武杰，薛景景，胡小飛，田 輝，張盼濤 , 田克恭

（1.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，洛陽 471000；2.普萊柯生物工程股份有限公司，洛陽 471000）

雞新城疫（newcastle disease, ND）是由雞新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）強(qiáng)毒株引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染疾病，該病對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，尤其對亞洲、中東和非洲的危害最為嚴(yán)重[1]。H9N2禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）是另一種對家禽危害嚴(yán)重，流行最為廣泛的一種低致病性AIV[2]，可引起蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和質(zhì)量下降，與其他病原共感染時可造成較高的發(fā)病率和死亡率[3-6]。疫苗免疫是預(yù)防和控制雞新城疫和H9亞型禽流感的有效措施之一。目前實際生產(chǎn)中普遍使用ND活疫苗和滅活疫苗對ND進(jìn)行免疫防控，用于生產(chǎn)ND活疫苗的毒株有低毒力的HB1株、La Sota株、Clone30株、VG/GA株、V4/HB92克隆株，而滅活疫苗毒株主要是La Sota株[7]，近年來也有NDV基因Ⅶ型相關(guān)滅活疫苗用于臨床。H9亞型禽流感滅活疫苗的廣泛應(yīng)用使得該病的流行得到有效控制，由于禽流感病毒HA基因易變異[8-10]，因此需根據(jù)流行趨勢的變化，及時更新疫苗毒株。

基于礦物油為佐劑的常規(guī)雞新城疫、H9亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗是商品肉雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用最多的疫苗之一，對控制肉雞ND和H9亞型AI發(fā)揮了重要作用。但因肉雞的飼養(yǎng)周期短，尤其是快大型白羽肉雞42日齡即可出欄，常規(guī)疫苗抗原濃縮倍數(shù)低，并且為了保持疫苗的穩(wěn)定性，添加有一定比例的硬脂酸鋁，因此免疫劑量大，疫苗粘度大，注射部位易出現(xiàn)較重的副反應(yīng)，出欄屠宰時個別雞只仍能在疫苗注射部位觀察到未吸收疫苗。疫苗中不可代謝的礦物油佐劑成分不僅影響雞肉品質(zhì)，同時存在著一定的食品安全隱患[7]。本研究基于禽用新型無鋁油性佐劑，結(jié)合高倍濃縮的NDV La Sota株和H9N2亞型禽流感SZ株抗原制備新型佐劑雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)濃縮滅活疫苗。該生產(chǎn)工藝制備的疫苗免疫劑量小，抗體產(chǎn)生快，吸收代謝快，更適合應(yīng)用于商品肉雞的疫病防控。

1 材料與方法

1.1 病毒株和檢測抗原 雞新城疫病毒La Sota株、H9亞型禽流感病毒SZ株均由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心分離、鑒定、保存；雞新城疫北京株強(qiáng)毒購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞新城疫病毒血凝抑制試驗抗原（HI）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗抗原（SZ株），由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心制備。

1.2 原輔材料 禽用新型無鋁油性佐劑、常規(guī)白油佐劑、甲醛均由普萊柯生物工程股份有限公司GMP車間提供。

1.3 試驗動物和試驗場所 SPF雞胚由購自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司的SPF雞種蛋孵化。1日齡商品代AA白羽肉雞購自洛陽周邊某孵化場，于普萊柯生物工程股份有限公司禽用負(fù)壓區(qū)動物房飼養(yǎng)至7日齡開展試驗。

1.4 疫苗制備 雞新城疫病毒La Sota株、H9亞型禽流感病毒SZ株利用無菌生理鹽水分別進(jìn)行10 000倍稀釋，0.2 mL/胚接種10～11日齡的SPF雞胚。接胚后收取72～96 h存活和死亡雞胚的尿囊液，收獲的兩種病毒雞胚尿囊液對1%雞紅細(xì)胞的血凝效價應(yīng)不低于8log2，病毒含量應(yīng)不低于108.0EID50/0.1 mL，每種雞胚尿囊液利用超濾濃縮裝置分別進(jìn)行2倍和4倍濃縮。對濃縮后的雞胚尿囊液使用終濃度為0.2%的甲醛溶液37℃水浴滅活18 h，滅活檢驗合格后用于疫苗制備。

疫苗的制備：新佐劑新流二聯(lián)濃縮苗抗原部分由4倍濃縮的雞新城疫抗原和H9亞型禽流感抗原等體積混合而成；常規(guī)新流二聯(lián)苗抗原部分由4倍濃縮的雞新城疫抗原和H9亞型禽流感抗原等體積混合而成；均按照96份抗原加入4份吐溫-80混合均勻作為水相，水相和油相比例為1∶2乳化制備疫苗。新佐劑新流二聯(lián)濃縮苗油相使用新型無鋁油性佐劑，常規(guī)新流二聯(lián)苗使用常規(guī)白油佐劑。

1.5 免疫分組及試驗設(shè)計 140羽7日齡AA肉雞分為三組，第1組和第2組均為50羽/組，第3組為40羽。第1組0.15 mL/羽免疫新佐劑新流二聯(lián)濃縮苗，第2組0.3 mL/羽免疫常規(guī)新流二聯(lián)苗，兩種疫苗均為頸背部皮下免疫。第3組為空白對照組，不免疫任何疫苗。

1.6 疫苗安全性評價 免疫后每日觀察并記錄免疫雞與對照雞的精神、采食、飲水等狀況，觀察至試驗結(jié)束。另外，每日隨機(jī)抽取20羽免疫雞，觀察疫苗注射部位是否有腫脹、硬結(jié)、化膿等不良炎性反應(yīng)，連續(xù)觀察14 d。分別于疫苗免疫后第7、14、21、28 d，從免疫組和對照組中各隨機(jī)抽取3羽剖殺，檢查注射局部變化和疫苗吸收情況。

同時，為評價疫苗免疫對肉雞生長性能的影響，分別于疫苗接種當(dāng)日、免后第14 d、免后35 d隨機(jī)從免疫組和對照組中各抽取15羽稱重，并統(tǒng)計結(jié)果。

1.7 疫苗有效性評價 （1）抗體檢測 免疫當(dāng)日、免疫后第7 、10、14、21、35 d從免疫雞和對照雞中隨機(jī)各取10羽采血并分離血清，分別檢測NDV HI和H9 AIV HI抗體。（2）攻毒保護(hù) 于免疫后第7 d，從兩個免疫組中各抽取10羽，從空白對照雞中抽取5羽進(jìn)行NDV攻毒保護(hù)效果評價，通過肌肉注射途徑進(jìn)行新城疫病毒北京株攻毒，105.0ELD50/羽，攻毒后連續(xù)觀察14 d，當(dāng)出現(xiàn)①死亡；②食欲明顯下降，甚至廢絕；③嗜睡、頭頸、尾部節(jié)律性震顫等神經(jīng)癥狀任一項癥狀即判為發(fā)病。攻毒后第5 d采集泄殖腔棉拭子接種10～11日齡SPF雞胚進(jìn)行病毒分離，每個樣品按照0.1 mL/胚的劑量接種5枚雞胚，接種后培養(yǎng)120 h，測定每胚尿囊液的HA效價。5枚雞胚只要有1枚HA效價不低于1∶16（微量法），即可判定病毒分離陽性。對于病毒分離陰性的樣品，應(yīng)盲傳1代后再進(jìn)行判定。同時，從兩個免疫組中各抽取10羽，從空白對照雞中抽取5羽進(jìn)行H9亞型禽流感攻毒保護(hù)效果評價，通過靜脈注射途徑進(jìn)行禽流感病毒（H9亞型）SZ株攻毒，每羽接種107.0EID50/200 μL，H9N2亞型禽流感病毒屬于低致病力病毒，感染SPF雞后無任何臨床癥狀，僅通過排毒檢測評價疫苗的免疫攻毒保護(hù)效果。攻毒后第5 d采集喉頭和泄殖腔棉拭子，每只雞兩種棉拭子混合后作為一個樣品接種10～11日齡SPF雞胚進(jìn)行病毒分離，病毒分離方式及結(jié)果判定同新城疫病毒。

2 結(jié)果

2.1 疫苗安全性評價結(jié)果 7日齡AA肉雞免疫新佐劑新流二聯(lián)濃縮苗和常規(guī)新流二聯(lián)苗后整個試驗期內(nèi)精神、采食、飲水與不免疫對照雞均無明顯差異。疫苗注射后14 d內(nèi)，每日隨機(jī)抽取20羽免疫雞，檢查注射部位均無硬結(jié)、腫脹和潰爛發(fā)生。免疫后第7、14、21、28 d從免疫組和不免疫對照雞中各隨機(jī)抽取3羽剖殺，檢查疫苗注射部位均無硬結(jié)、膿腫、潰爛和壞死發(fā)生，新佐劑新流二聯(lián)濃縮苗免疫后14 d疫苗即完全吸收，眼觀無疫苗存在，而常規(guī)新流二聯(lián)苗免疫后21 d仍有少量未吸收疫苗，免疫后28 d疫苗吸收完全。結(jié)果詳見表1。于疫苗接種當(dāng)日、免后14和35 d，從免疫雞及對照雞中隨機(jī)各取15羽稱重，結(jié)果顯示，免疫雞與對照雞在同一時間點的體重?zé)o明顯差異，表明雞群在免疫后其生長性能均未受到影響，疫苗安全性良好。結(jié)果詳見圖1。

圖1 AA肉雞不同疫苗免疫后體重變化Fig.1 Body weight changes of AA broilers immunized with different vaccines

表1 AA肉雞不同疫苗免疫后疫苗吸收情況Table 1 Absorption of AA broilers after immunization with different vaccines

2.2 抗體檢測結(jié)果 免疫當(dāng)日、免疫后第7、10、14、21、35 d從兩種疫苗免疫雞和對照雞中各隨機(jī)取10羽采血并分離血清，分別檢測ND HI和H9亞型AI HI抗體。結(jié)果顯示，不免疫對照組ND和H9 AI HI抗體免疫當(dāng)天（7日齡）分別為4.2±1.4 log2和3.8±1.2 log2，隨著日齡增大，母源抗體緩慢降低，21日齡時已低于2.0 log2。新佐劑新流二聯(lián)濃縮苗和常規(guī)新流二聯(lián)苗免疫組肉雞免疫后ND和H9 AI HI抗體緩慢上升，免疫后第21 d（28日齡）抗體水平達(dá)到或接近高峰，并一直持續(xù)到42日齡（免疫后35 d）。新佐劑新流二聯(lián)濃縮苗ND和H9 AI的HI抗體產(chǎn)生速度優(yōu)于常規(guī)新流二聯(lián)苗，前者免疫后第7 d ND和H9 AI的HI抗體分別為6.1±0.88 log2和6.8±0.63 log2，優(yōu)于常規(guī)新流二聯(lián)苗的4.7±1.2 log2和5.2±0.79 log2。疫苗免疫后21～35 d，新佐劑新流二聯(lián)濃縮苗ND和H9 AI的HI抗體達(dá)到高峰，分別為8.4±0.7 log2和8.7±0.82 log2，高于常規(guī)新流二聯(lián)苗的7.5±1.3 log2和8.1±1.0 log2。結(jié)果詳見圖2、圖3。

圖2 肉雞免后不同時間NDV HI抗體效價Fig.2 Titer of NDV HI antibody in broilers at different time after immunization

圖3 肉雞免后不同時間H9 AIV HI抗體效價Fig.3 Titer of H9 AIV HI antibody in broilers at different time after immunization

2.3 攻毒保護(hù)結(jié)果 免疫后第7 d，從兩種疫苗免疫雞中各隨機(jī)抽取20只，連同對照雞10只分別進(jìn)行新城疫病毒北京株和禽流感病毒（H9亞型）SZ株攻毒保護(hù)試驗，攻毒時每個病原免疫組攻10羽，不免疫對照組攻5羽。結(jié)果顯示，新城疫攻毒后對照組全部死亡，新佐劑新流二聯(lián)濃縮苗免疫組雞無發(fā)病和死亡，病毒分離陽性率為0（0/10）。常規(guī)新流二聯(lián)苗免疫組雞無死亡，30%（3/10）表現(xiàn)出NDV特征性臨床癥狀，病毒分離陽性率為60%（6/10）。同時，免疫后第7 d對兩種疫苗免疫雞進(jìn)行H9亞型禽流感病毒攻毒，攻毒對照組病毒分離陽性率100%（5/5），新佐劑新流二聯(lián)濃縮苗免疫組雞病毒分離陽性率為0（0/10），常規(guī)新流二聯(lián)苗免疫組雞病毒分離陽性率為50%（5/10）。上述攻毒保護(hù)結(jié)果表明，新佐劑新流二聯(lián)濃縮苗免疫后第7 d即可為免疫雞提供針對NDV和H9亞型禽流感的完全攻毒保護(hù)，免疫效果優(yōu)于常規(guī)新流二聯(lián)苗。結(jié)果詳見表2。

表2 AA肉雞免后7 d NDV和H9N2 AIV攻毒保護(hù)效果Table 2 Protection effect of NDV and H9N2 AIV challenge on AA broilers 7 days after immunization

3 討論

雞新城疫和H9亞型禽流感是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病，疫苗免疫作為預(yù)防這兩種疾病的重要措施被廣泛應(yīng)用。常規(guī)油乳劑雞新流二聯(lián)滅活疫苗抗原含量低，免疫劑量大，免疫后抗體產(chǎn)生速度慢、滴度低，尤其是針對快大型白羽肉雞免疫效果更不理想。同時為了保持疫苗穩(wěn)定性，常規(guī)油乳劑疫苗中添加有一定比例的硬脂酸鋁[11-12]，疫苗粘度可達(dá)50～100 cP，免疫應(yīng)激大，接種部位易出現(xiàn)肉芽腫，引起腫脹、硬結(jié)和壞死，造成疫苗吸收慢，延緩抗體產(chǎn)生速度，增加疫苗免疫后的空白期。在目前尚無免疫效果理想的水佐劑可用于肉雞滅活疫苗生產(chǎn)的情況下，常規(guī)的礦物油佐劑疫苗依然是肉雞養(yǎng)殖生產(chǎn)的必需品，亟需對其免疫劑量、吸收速度、抗體產(chǎn)生速度進(jìn)行改進(jìn)。

抗原濃縮是提高疫苗單位體積內(nèi)抗原含量的重要手段，使用濃縮苗可降低人力和物力，節(jié)省成本、較少應(yīng)激、提高雞群質(zhì)量，并且濃縮苗抗體產(chǎn)生速度快、滴度高、持續(xù)時間長[13-15]。本研究使用“粗濾+超濾”的抗原濃縮工藝，實現(xiàn)了NDV La Sota株、H9 AIV SZ株抗原4倍的超強(qiáng)濃縮。為改善常規(guī)油乳劑滅活苗粘度大的問題，本研究用人工合成的異甘露醇單油酸脂替代硬脂酸鋁，與硫酸葡聚糖、卵磷脂及礦物油等成分進(jìn)行適當(dāng)配比制備禽用新型無鋁油性佐劑，該新型佐劑制備的雞新流二聯(lián)滅活疫苗粘度低至10～20 cP，解決了常規(guī)礦物油佐劑疫苗粘度高，易引起免疫副反應(yīng)的不足，并可加快疫苗中抗原在機(jī)體內(nèi)的釋放速度，加快抗體產(chǎn)生速度，0.15 mL/羽的使用劑量，免疫后第7 d NDV和H9亞型禽流感的HI抗體即可達(dá)到6.1 log2和6.8 log2，抗體水平和均勻度均優(yōu)于常規(guī)雞新流二聯(lián)苗。新佐劑雞新流二聯(lián)濃縮苗免疫后第7 d即可為免疫雞提供針對NDV和H9N2禽流感病毒的完全攻毒保護(hù)，免疫雞不發(fā)病、不排毒，攻毒保護(hù)效果明顯優(yōu)于常規(guī)雞新流二聯(lián)苗。

本研究由于免疫雞數(shù)量少，常規(guī)油佐劑新流二聯(lián)疫苗免疫后未出現(xiàn)硬結(jié)、腫脹等不良反應(yīng)，新型無鋁油性佐劑與高倍濃縮抗原制備的二聯(lián)濃縮苗優(yōu)勢未能顯現(xiàn)出來，但免疫劑量由0.3 mL/羽降低為0.15 mL/羽，免疫后第14 d疫苗即可吸收完全的優(yōu)勢對肉雞生產(chǎn)意義重大。對飼養(yǎng)周期長的種雞和蛋雞，整個飼養(yǎng)期疫苗免疫次數(shù)可高達(dá)30余次，不僅造成雞體應(yīng)激反應(yīng)大，同時耗時、費力、增加養(yǎng)殖成本。新型無鋁油性佐劑與高倍濃縮抗原的有機(jī)結(jié)合和應(yīng)用推廣，可解決當(dāng)前常規(guī)禽用油乳劑滅活疫苗存在的不足，推進(jìn)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。