徐常艷 王小莉 萬 晨 楊浩宇 邱 禹 許夢夢 吳宜修 常雪蓮 袁 圓 李徽徽 褚 亮 楊小迪

(1.蚌埠醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，安徽蚌埠 233030；2.感染與免疫安徽省重點實驗室，安徽蚌埠 233030；3.蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，安徽蚌埠 233030)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是指由于各種原因導致的脊髓完全或不完全傷害，最終造成病人完全或不完全性癱瘓(Eftekharpouretal., 2008)。SCI的病理過程分為急性期(0～7 d)、 亞急性期(7～14 d)和慢性期(>14 d)(Badhiwalaetal., 2021)。SCI病理進程分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷是外力直接或間接作用于脊髓所造成的機械性損傷(Kasinathanetal., 2015)，而繼發(fā)性損傷則是指脊髓組織對創(chuàng)傷所產生的包括局部水腫、缺血、缺氧、自由基積聚和炎癥反應等一系列細胞和分子機制的改變(Okadaetal., 2018)。SCI后，炎癥反應相關小膠質細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、抗體和細胞因子等對SCI病理進展產生重要影響(Rustetal., 2017)，也影響著繼發(fā)性損傷進程和損傷后的功能恢復程度，因此，減輕繼發(fā)性損傷引起的炎癥反應成為SCI研究的重點之一。

旋毛蟲Trichinellaspiralis作為一種可在人體長期寄生的組織內線蟲，可通過其排泄—分泌產物作用，抑制過度的免疫應答及劇烈的炎癥反應，修復蟲體在寄生過程中對機體造成的損傷，營造利于其長時間寄生的微環(huán)境(Whelanetal., 2012; Steinfelderetal., 2016; Coakleyetal., 2020)。有研究表明旋毛蟲感染可改善呼吸道合胞病毒誘導的炎癥性反應(Chuetal., 2020)，本課題組前期亦證實，旋毛蟲及其衍生蛋白可顯著緩解小鼠急性潰瘍性結腸炎(Yangetal., 2014)、哮喘(Sunetal., 2019)、膿毒癥(李徽徽等, 2016; 楊小迪等, 2016; Lietal., 2021)，但旋毛蟲及其衍生蛋白是否對SCI有改善作用未見報道。本研究采用旋毛蟲預感染對急性SCI小鼠進行干預，檢測其預防效果并初步分析其作用機制，旨在為蠕蟲或蟲源性分子治療和預防SCI提供實驗基礎及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及蟲株

SPF級C57BL/6小鼠(雌性，6～8周齡)，購自常州卡文斯實驗動物有限公司(SCXK(蘇)2016-0010)。雌性ICR小鼠，20～23 g/只，購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司。(22±2)℃常溫環(huán)境，自由飲食，飼養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心。河南豬源旋毛蟲株由鄭州大學基礎醫(yī)學院崔晶教授惠贈，本實驗室經ICR小鼠傳代保種。本研究獲得蚌埠醫(yī)學院倫理審查委員會批準(倫理編號：倫動科批字[2021]第324號)。

1.2 主要試劑與材料

胃蛋白酶(國藥集團化學試劑有限公司)、明膠(Sigma)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(Biosharp 公司)；Trizol (Thermo Fisher)；蘇木精伊紅染色試劑盒(碧云天)；4%多聚甲醛、石蠟和二甲苯(麥克林公司)；ELISA試劑盒購自上海達科為公司(IL-6、IL-10、TNF-α)和ABclonal公司(TGF-β)；逆轉錄試劑盒(Thermo scientific)、實時熒光定量PCR試劑盒(Sangon Biotech)。

1.3 脊髓損傷動物造模

C57BL/6小鼠腹腔注射5%水合氯醛，充分麻醉后，切開皮膚和肌肉，暴露胸段棘突，咬除T9的椎板，暴露脊髓，通過夾持T7和T11棘突來穩(wěn)定脊柱，用直徑1.3 mm的鉆頭以合適的力度建立中度SCI模型。SCI后，止血、縫合各層組織(Chenetal., 2020)。假手術小鼠只打開椎板，不損傷脊膜及脊髓。術后小鼠置于暖光燈下復蘇，蘇醒后Basso小鼠評分(Basso mouse scale, BMS)標準評分0分，判斷為建模成功。術后分籠飼養(yǎng)，每天早、晚擠壓膀胱協(xié)助排尿兩次，連續(xù)7 d給予小鼠皮下注射青霉素預防感染。

1.4 旋毛蟲肌幼蟲分離及實驗分組

取經旋毛蟲感染的ICR小鼠，麻醉后頸椎脫臼處死，去除小鼠的頭部、皮毛、內臟和脂肪，分離出剩余肌肉后，用胃蛋白酶消化法消化，收集肌幼蟲，并混懸于4%明膠，定量計數(shù)后，以350條肌幼蟲經口灌胃感染相應組別實驗鼠。將C57BL/6小鼠隨機分為4組：A組為假手術組、B組為旋毛蟲預感染后14 d+假手術組、C組為脊髓損傷組、D組為旋毛蟲預感染后14 d+脊髓損傷組。

1.5 后肢運動功能檢測

分別于術后第7天，采用詳細的BMS標準，在曠場中對各組小鼠后肢功能進行評估。把小鼠放置在曠場中，提前熟悉環(huán)境10 min，觀察分析后打分，BMS是10分制(0～9)，0分代表后肢完全癱瘓，9分代表后肢運動功能正常，評分越高則表示小鼠后肢功能越健全(Bassoetal., 2006)。評分均采用雙人雙盲獨立觀察與記錄，實驗重復3次，取平均值。

1.6 樣本準備

1.6.1脊髓的提?。焊鹘M小鼠于術后7 d取材，小鼠乙醚麻醉后斷頭處死，剪開背部皮膚和肌肉，自損傷區(qū)向頭側和尾側各打開2～3個錐板，以損傷區(qū)為中心取1 cm脊髓置于無RNA酶的凍存管中，-80 ℃保存。

1.6.2血清的分離：各組小鼠于術后 7 d 實施眼球采血，將采集的血液置于潔凈干燥的1.5 mL離心管內，待其自然凝固后，分離血清。將分離的血清分裝于無菌 EP 管內，置于-80℃保存。

1.7 脊髓組織HE染色

經4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，行HE染色，在光學顯微鏡下觀察脊髓組織病理損傷程度，在切片上隨機選擇3個以上相同大小的視野，用image pro plus 6軟件計數(shù)HE染色切片中炎性細胞的數(shù)量(cells/mm2)，按炎性細胞數(shù)/組織面積求平均值。

1.8 脊髓組織總RNA提取、反轉錄和Real-time PCR檢測

脊髓總RNA提取依據(jù)試劑盒說明書操作，引物逆轉錄后，通過RT-PCR檢測各組小鼠脊髓組織中IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β mRNA的相對表達量。使用β-actin作為管家基因，所有引物如表1所示，采用20 μL體系(SYBR buffer 10 μL，正反向引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL)進行RT-PCR擴增，反應條件為95℃3 min，95℃30 s，58℃30 s，72℃15 s，45個循環(huán)。

表1 引物序列信息

1.9 ELISA檢測血清炎癥因子

按ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測各組小鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β水平。酶標儀檢測450 nm處吸光度值，并計算各因子含量。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 旋毛蟲預感染對急性脊髓損傷小鼠運動功能的影響

A和B組小鼠BMS行為學評分均為(9.00±0.00)分，SCI造模后第7天，C、D組小鼠BMS評分的平均分分別為(0.65±0.23)和(1.40±0.35)分。4組小鼠BMS評分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與A組小鼠相比，C組小鼠 BMS 評分明顯降低(P均 <0.05)；D組小鼠BMS評分高于C組小鼠(P<0.05)，后肢癥狀明顯減輕(圖1)。

圖1 各組小鼠BMS評分

2.2 旋毛蟲預感染對急性脊髓損傷小鼠組織病理變化的影響

術后7 d，A和B組小鼠脊髓組織結構完整，無明顯炎癥細胞浸潤現(xiàn)象。C組小鼠脊髓組織結構明顯損傷，出現(xiàn)脊髓充血、水腫等現(xiàn)象，側索、背側及中央灰質脊髓空洞增大，炎癥細胞浸潤增多。在旋毛蟲預感染后，D組小鼠與C組相比，脊髓組織病理損傷得到改善，背側白質及中央灰質組織破壞程度減小，炎癥細胞浸潤得到抑制(P<0.05)(圖2)。

圖2 各組小鼠脊髓組織病理學改變(HE染色)

2.3 旋毛蟲預感染對小鼠急性脊髓損傷組織中炎癥因子基因表達的影響

利用RT-PCR檢測脊髓組織中促炎因子IL-6和TNF-α的mRNA的表達情況，結果顯示：SCI組分別為(1.36 ± 0.09)和(1.88 ± 0.17)，較假手術組的(0.99 ± 0.05)和(1.01 ± 0.05)明顯升高(P<0.05)。經旋毛蟲預感染干預后，T.spiralis+SCI組上述兩種促炎因子分別為(0.49 ± 0.12)和(0.69 ± 0.13)，較SCI組明顯降低(P<0.05)。檢測脊髓中抗炎細胞因子IL-10和TGF-β mRNA的表達情況，結果顯示：假手術組和SCI組的IL-10分別為(1.01 ± 0.09)和(1.06 ± 0.12)，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)；SCI組的TGF-β為(3.26 ± 0.42)，較假手術組(1.02 ± 0.08)顯著升高(P<0.05)。經旋毛蟲預感染干預后，T.spiralis+ SCI組IL-10和TGF-β分別為(1.57 ± 0.14)和(4.55 ± 0.28)，較SCI組明顯升高(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組小鼠脊髓組織中炎癥因子mRNA的表達

2.4 旋毛蟲預感染對急性脊髓損傷小鼠血清中炎癥因子的影響

利用ELISA檢測血清中促炎因子IL-6和TNF-α的結果顯示：SCI組分別為(36.39 ± 3.32)和(90.41 ± 5.84)pg/mL，較假手術組的(23.00 ± 2.68)和(47.03 ± 1.89)pg/mL顯著升高(P<0.05)。經旋毛蟲預感染干預后，T.spiralis+SCI組上述兩種促炎因子分別為(22.45 ± 1.82)和(43.83 ± 4.19)pg/mL，較SCI組明顯降低(P<0.05)。檢測血清中抗炎細胞因子IL-10和TGF-β的結果顯示：假手術組和SCI組的IL-10分別為(28.08 ± 1.06)和(28.41 ± 1.08)pg/mL，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，假手術組和SCI組的TGF-β分別為(21 984.56 ± 677.66)和(23 191.73 ± 783.52)pg/mL，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。經旋毛蟲預感染干預后，T.spiralis+SCI組上述兩種抗炎細胞因子分別為(32.80 ± 2.18)和(35 189.79 ± 1 296.04)pg/mL，較SCI組明顯升高(P<0.05)(圖4)。

圖4 各組小鼠血清中炎癥因子的水平

3 討論

SCI是一個致殘率高、功能恢復差的疾病(Campagnoloetal., 2000; Wuetal., 2009)，可嚴重影響患者的生命健康和生活質量，給患者家庭以及社會造成沉重的經濟負擔(馬海萍等, 2013)。目前急性SCI主要采用外科減壓手術、神經營養(yǎng)、激素治療及康復干預等臨床綜合治療，但由于脊髓損傷后其神經再生能力弱,修復受損脊髓組織并使其實現(xiàn)功能正常化仍是目前醫(yī)學難題，其治療效果并不理想(馮浩銘等, 2021; 趙興昌等, 2022)。因此，探索新型治療藥物或方法已成為脊柱外科的研究熱點之一。多項研究表明，旋毛蟲及其衍生蛋白可通過誘導調節(jié)性T細胞增殖及巨噬細胞極化，降低促炎細胞因子釋放，促進抑炎因子分泌，顯著改善哮喘、炎癥性腸炎和實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎等疾病癥狀(Baietal., 2012; 丁憶晗等, 2016; Kangetal., 2019)。本研究通過旋毛蟲預感染觀察其對小鼠急性SCI修復效果，發(fā)現(xiàn)旋毛蟲預感染干預后SCI小鼠行為學BMS評分明顯升高，脊髓組織病理損傷有所改善，表明旋毛蟲預感染對小鼠急性SCI具有保護作用，這對于進一步研發(fā)旋毛蟲及其衍生物用于SCI治療提供了新思路。

脊髓損傷后外源性和內源性有害物質可通過血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)，局部和全身炎癥因子變化不僅可預測SCI的進展，對SCI康復預后同樣至關重要。IL-6可參與調節(jié)和刺激免疫細胞的生長，TNF-α是一種主要由小膠質細胞表達的促炎因子，兩者被認為是SCI后潛在的炎癥反應標記物(閔令霞等, 2021)。IL-10主要表達在單核細胞和調節(jié)性T細胞中，是重要的炎癥抑制因子。而TGF-β可參與Foxp3+調節(jié)性T細胞和Th17細胞的免疫調節(jié)作用(鄭晶晶等, 2012)。本研究分析了IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β在局部脊髓組織和血清中的表達水平，結果顯示旋毛蟲預感染對于正常小鼠幾乎無影響；與空白對照組相比，SCI造模小鼠脊髓組織和血清中促炎因子IL-6、TNF-α表達水平均升高，在血清中抑炎因子IL-10、TGF-β水平無明顯改變，表明SCI后炎癥細胞能分泌較多IL-6、TNF-α等，而IL-10、TGF-β等表達較少，支持了在SCI急性期促炎因子占主導地位，而抑炎因子表達較低，這也是導致SCI繼發(fā)性病理損傷的重要機制(Sunetal., 2016; Ahmedetal., 2018)。本研究發(fā)現(xiàn)在旋毛蟲感染干預后，與SCI組比較，脊髓局部和血清中IL-6和TNF-α水平明顯下降，IL-10和TGF-β水平顯著升高。結合行為學變化和病理組織改變，提示旋毛蟲預感染調控了小鼠SCI急性期炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的產生水平，改善了損傷脊髓炎癥微環(huán)境，為SCI后修復創(chuàng)造了有利條件。

研究表明，在旋毛蟲感染后，不僅能引起宿主Th2型免疫應答，同時也有Th1型免疫應答的參與，是細胞免疫與體液免疫共同作用的結果，其可進一步調控機體炎癥因子的表達(茍強, 2014)。炎癥因子是重要的免疫調節(jié)介質，SCI后促炎因子和抗炎因子的表達差異可能是損傷區(qū)炎癥反應擴大，進一步造成脊髓繼發(fā)免疫損傷的重要因素。適時局部或系統(tǒng)地調節(jié)不同炎癥因子的表達，進而調節(jié)機體免疫反應，對于減小繼發(fā)損傷促進SCI的修復有重要作用(Ferbertetal., 2017)。本研究表明旋毛蟲預感染可通過調控炎癥因子水平，對小鼠SCI急性期發(fā)揮保護作用，提示了旋毛蟲及其衍生蛋白具有治療炎癥性疾病的潛力。鑒于直接用旋毛蟲治療疾病具有安全性問題(陳玉瑩等, 2021)，旋毛蟲來源的抗炎活性分子的篩選和驗證仍有待于進一步探索。