隋鳳翔 鄭義 楊芷怡 李曉巖 牛犇

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

松樹枯梢病是一種世界范圍內(nèi)分布最廣泛的松樹病害，其病原菌為松杉球殼孢(Sphaeropsissapinea)，該菌主要侵害樟子松、黑松、油松、紅松、馬尾松等針葉樹，影響范圍大，發(fā)展速度快，嚴重時可導(dǎo)致林木大面積枯死，造成嚴重經(jīng)濟損失[1]。目前防治松樹枯梢病的方法主要是化學(xué)防治，然而，化學(xué)藥劑的頻繁使用不僅會使病原菌產(chǎn)生耐藥性，還會導(dǎo)致越來越嚴重的環(huán)境污染和生態(tài)破壞[2-3]。因此，開展松樹枯梢病的生物防治十分必要?；谖⑸镛卓箘┑纳锓乐尉哂协h(huán)境友好且耐藥性低等優(yōu)點，是實現(xiàn)對松樹枯梢病綠色防控的重要選項之一。

瓦雷茲芽孢桿菌(Bacillusvelezensis，曾用名B.amyloliquefacienssubsp.plantarum)FZB42是重要的植物促生根際細菌(plant growth promoting rhizobacterium，PGPR)[4]。此外，基因組測序結(jié)果分析顯示，菌株FZB42含有11個與次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因簇，能夠通過非核糖體途徑及核糖體途徑合成多種脂肽類(bacillomycin D，fengycin，surfactin)、聚酮類(bacillaene，difficidin，macrolactin)及多肽類(plantazolicin，amylocyclicin)抑菌活性物質(zhì)，具有顯著的生防潛力[4-6]。研究表明，F(xiàn)ZB42可抑制尖孢鐮刀菌等多種病原菌的生長，但其對松杉球殼孢的潛在影響尚未被充分評價[7]。本研究利用瓦雷茲芽孢桿菌FZB42對松杉球殼孢的抑菌效果進行了研究，并對其抑菌活性物質(zhì)進行了初步分離及抑菌效果驗證，以期深入解析其防治機理，為瓦雷茲芽孢桿菌FZB42作為松樹枯梢病生防制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌：瓦雷茲芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)FZB42，松杉球殼孢(Sphaeropsissapinea)，均為實驗室保存。

LB液體培養(yǎng)基：10 g NaCl、5 g酵母提取物、10 g胰蛋白胨，1 000 mL蒸餾水。

PDA培養(yǎng)基：46 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、1 000 mL蒸餾水。

Landy培養(yǎng)基：5 g L-谷氨酸、0.5 g KCl、0.15 mg FeSO4·6H2O、5.0 mg MnSO4·H2O、0.16 mg CuSO4·5H2O，加入超純水使終體積為940 mL，調(diào)節(jié)pH=7.0，分裝至三角瓶中，121 ℃高壓滅菌鍋滅菌20 min；40%葡萄糖50 mL、10% KH2PO410 mL，分裝至三角瓶，115 ℃高壓滅菌15 min，將兩瓶液體混合均勻，待用。

MSGG培養(yǎng)基：50 mL 0.1 mol/L Pot. phosphate buffer、100 mL 1 mol/L MOPS、10 mL 5 mmol/L FeCl3、10 mL 200 mmol/L MgCl2、5 mL 10 mmol/L MnCl2、0.1 mL 10 mmol/L ZnCl2、1 mL 2 mmol/L硫胺素、5 mL 10 g/L色氨酸、5 mL 10 g/L苯基丙氨酸、5 mL 10 g/L蘇氨酸、25 mL 20%丙三醇、25 mL 20%谷氨酸鹽、700 μL 1 mol/L CaCl2、758.2 mL ddH2O。

硫酸銨、胃蛋白酶、PBS等購于天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42體外抑菌活性測定

瓦雷茲芽孢桿菌FZB42抑菌活性測定采用平板對峙法[8]。將瓦雷茲芽孢桿菌FZB42從冰箱(-80 ℃)取出，使用平板劃線法接種于LB固體培養(yǎng)基中，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。將松杉球殼孢接種于固體PDA培養(yǎng)基，放置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，待用。挑取瓦雷茲芽孢桿菌FZB42單菌落，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，放置于搖床中30 ℃培養(yǎng)16 h，測定菌液在600 nm處的吸光度，并將其調(diào)整至OD600=1(以LB液體培養(yǎng)基作為空白對照)。利用5 mm打孔器在上述松杉球殼孢菌落邊緣打菌柄，并將菌絲面向下接種至PDA培養(yǎng)基中央。取上述FZB42菌液2 μL分別接種于距中央菌餅3.5 cm處的4個方向。設(shè)定3個重復(fù)。培養(yǎng)4 d后觀察拮抗結(jié)果，通過測量抑菌圈大小，根據(jù)下述公式計算抑制率：

抑制率=((對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑)×100%。

1.3 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液的制備及抑菌活性測定

采用Landy培養(yǎng)基制備瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液。選取500 mL三角瓶，按照器皿體積與培養(yǎng)液以體積比10∶1的比例加入50 mL Landy培養(yǎng)液，將瓦雷茲芽孢桿菌FZB42菌液1 mL(OD600=1)接種于Landy培養(yǎng)液中，置于搖床中30 ℃培養(yǎng)60 h，設(shè)定空白Landy培養(yǎng)液作為對照。發(fā)酵結(jié)束后，將瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液離心(6 000 r/min，30 min)取上清，重復(fù)上述操作，直至肉眼觀察無菌液沉淀后，取上清液，利用0.22 μm注射器驅(qū)動過濾器過濾細菌，得到瓦雷茲芽孢桿菌FZB42的發(fā)酵濾液。

將制備好的瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵濾液與PDA培養(yǎng)基按照體積比1∶5的比例混合測定發(fā)酵濾液的抑菌活性。將5 mL FZB42發(fā)酵濾液與PDA培養(yǎng)基混合液分別加入到6孔板中，待其凝固后，取直徑5 mm的松杉球殼孢菌餅接種于每孔中央，設(shè)定空白PDA培養(yǎng)基作為對照，置于培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)1 d，觀察抑菌結(jié)果，分別測定實驗組和對照組的測量菌落半徑，并計算抑制率。

在PDA培養(yǎng)基中央接種直徑8 mm的松杉球殼孢菌餅，并在菌餅周圍距菌餅相同直徑處以45°插入蓋玻片若干，放置于培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)5 d，使松杉球殼孢菌絲生長至蓋玻片上。將表面有松杉球殼孢菌絲的蓋玻片浸泡在FZB42 Landy發(fā)酵濾液中培養(yǎng)2 d，利用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)的變化，設(shè)定空白對照。

1.4 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液抗菌肽的粗提及抑菌活性測定

采用硫酸銨沉淀法分離提取FZB42發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)[9]。分別向20 mL FZB42發(fā)酵濾液中加入固體硫酸銨，直至最終飽和度達到60%和90%，置于冰箱4 ℃過夜沉淀，次日離心(10 000 r/min，4 ℃，30 min)，去上清，收集沉淀。用5 mL PBS(10 mmol/L，pH=7.5)將上述沉淀物充分溶解，并將其放入分子質(zhì)量為10 ku的透析袋中進行透析脫鹽24 h，然后用10 mmol/L PBS (pH7.5)稀釋至20 mL，得到FZB42發(fā)酵液肽類粗提物。將上述粗提取物與PDA培養(yǎng)基以體積比1∶5的比例混合，測定其對松杉球殼孢的抑菌效果，設(shè)定空白對照(PBS，10 mmol/L pH=7.5)。

為驗證60%和90%飽和度的硫酸銨得到的沉淀為粗蛋白，在上述發(fā)酵液肽類粗提物中加入胃蛋白酶(終質(zhì)量濃度為1 g/L,pH=2.0)37 ℃處理2 h。將上述胃蛋白酶水解液pH調(diào)至8，將胃蛋白酶水解液與PDA培養(yǎng)基以體積比1∶5的比例混合，測定其對松杉球殼孢的抑菌效果，設(shè)定空白對照(PBS，10 mmol/L pH=7.5)。

1.5 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42定殖相關(guān)生物學(xué)性狀檢測

將瓦雷茲芽孢桿菌FZB42單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床30 ℃過夜培養(yǎng)，將OD600調(diào)至0.5，備用。

在96孔板中分別加入198 μL的MSGG液體培養(yǎng)基和2 μL上述瓦雷茲芽孢桿菌FZB42菌液，設(shè)定200 μL MSGG液體培養(yǎng)基作為空白對照，置于培養(yǎng)箱中30 ℃靜置培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，使用蒸餾水清洗96孔板3次后將其吸出，加入0.1%的結(jié)晶紫溶液染色30 min。染色結(jié)束后，吸去培養(yǎng)板中的結(jié)晶紫溶液，加入10%的醋酸溶液處理30 min，溶解與生物膜結(jié)合的結(jié)晶紫，利用酶標儀測定各孔在570 nm處的OD值[9]。

在24孔板中分別加入495 μL LB液體培養(yǎng)基和5 μL上述瓦雷茲芽孢桿菌FZB42菌液，設(shè)定500 μL LB液體培養(yǎng)基作為空白對照，置于培養(yǎng)箱中30 ℃靜置培養(yǎng)48 h。用牙簽將24孔培養(yǎng)板上每個孔的懸浮型生物膜挑起并移至2 mL離心管中，晾干后稱量每個孔中的生物膜質(zhì)量。

用高壓滅菌后的牙簽蘸取瓦雷茲芽孢桿菌FZB42菌液(OD600=0.5)菌液，使用牙簽穿刺法分別接種于含0.2%瓊脂的LB固體培養(yǎng)基(swimming運動性檢測)和含0.7%瓊脂的LB固體培養(yǎng)基(swarming運動性檢測)，避光靜置于培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)8～24 h，培養(yǎng)結(jié)束后拍照并測量菌落半徑[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42體外抑菌活性

如圖1所示，與空白對照組相比，瓦雷茲芽孢桿菌FZB42菌液處理組的松杉球殼孢平板出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，松杉球殼孢的生長受到顯著抑制，F(xiàn)ZB42對松杉球殼孢的抑制率為43.6%，說明瓦雷茲芽孢桿菌FZB42在體外具有較強的抑制松杉球殼孢生長的活性。

A為空白對照；B為B. velezensis FZB42處理組。

2.2 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液的體外抑菌活性評價

如圖2所示，未經(jīng)FZB42發(fā)酵液處理的松杉球殼孢生長良好，F(xiàn)ZB42發(fā)酵液(Landy培養(yǎng)基，60 h)可顯著抑制松杉球殼孢生長，抑制率高達98%。由此推測，F(xiàn)ZB42可通過合成分泌某些代謝物抑制松杉球殼孢生長。

通過顯微鏡觀察瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵濾液對松杉球殼孢菌絲生長的影響，結(jié)果如圖3所示。對照組菌絲生長良好，經(jīng)發(fā)酵濾液處理1 d，松杉球殼孢菌絲內(nèi)部出現(xiàn)較小較疏松的空泡，處理2 d后的菌絲表面出現(xiàn)了較明顯密集的突起和囊泡，菌絲形態(tài)受到嚴重破壞。

A為CK;B為B. velezensis FZB42 Landy培養(yǎng)基發(fā)酵液處理組。

A為CK，400×;B為發(fā)酵液處理1 d，400×;C為CK，100×;D為發(fā)酵液處理2 d，100×)。

2.3 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液抗菌肽的分離純化及其抑菌活性

為明確瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)，采用硫酸銨沉淀法分離肽類物質(zhì)并對其進行抑菌活性測定，結(jié)果如圖4和表1所示。結(jié)果表明，飽和度為60%和90%的硫酸銨粗提蛋白均能有效抑制松杉球殼孢生長，且兩種飽和度硫酸銨粗提蛋白對松杉球殼孢的抑菌率相差不大，60%硫酸銨粗提蛋白的抑菌率為63.7%，90%硫酸銨粗提蛋白抑菌率為62.8%，但均低于FZB42Landy培養(yǎng)基發(fā)酵濾液的抑菌率(96.1%)。使用胃蛋白酶水解粗提蛋白后，60%和90%飽和度硫酸銨粗提蛋白液對松杉球殼孢的抑制作用顯著減弱，分別降至8.6%和8.7%(表1)，可證明硫酸銨粗提蛋白在體外可抑制松杉球殼孢的生長。

2.4 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42菌株生物膜形成測定

FZB42在MSGG培養(yǎng)基中形成的生物膜如圖5所示。在96孔板中，未加入FZB42菌液的空白對照組為澄清、透明液體，證明試驗過程中沒有雜菌污染，加入FZB42菌液的每個孔中都形成了有褶皺并且結(jié)構(gòu)致密的細菌生物膜，利用結(jié)晶紫染色并通過酶標儀測量CK及試驗組OD570分別為0.10和3.27，結(jié)果如圖5B所示，說明FZB42具有較強的生物膜形成能力。用滅菌牙簽挑取FZB42在24孔板中形成的生物膜，烘干并稱其質(zhì)量，生物膜總干質(zhì)量為1.189 0 g，平均每孔干質(zhì)量為0.066 g。

A.60%硫酸銨粗提蛋白對松杉球殼孢的抑制試驗；B.90%硫酸銨粗提蛋白對松杉球殼孢的抑制試驗；C.FZB42發(fā)酵液對松杉球殼孢的抑制試驗；D.胃蛋白酶處理粗提蛋白物對松杉球殼孢的抑制試驗。

表1 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42發(fā)酵液及粗蛋白對松杉球殼孢的抑制率

A.FZB42生物膜表面形態(tài)，B.FZB42生物膜吸光值。

2.5 瓦雷茲芽孢桿菌FZB42運動性測定

細菌的運動能力與其定殖密切相關(guān)。如圖6所示，F(xiàn)ZB42培養(yǎng)12 h后，F(xiàn)ZB42在兩種不同瓊脂濃度的LB培養(yǎng)基中的菌落半徑均為4.25 cm，由此證明FZB42具有很好的swarming運動性和swimming運動性。

3 討論

芽孢桿菌作為生防細菌最常見的機制之一就是通過分泌次生代謝產(chǎn)物抑制病原菌的生長[10-12]。瓦雷茲芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)FZB42是一株具有高效生防性能的土壤細菌。瓦雷茲芽孢桿菌FZB42能夠產(chǎn)生多種抑菌化合物，包括聚酮類化合物(bacillaene、difficidin、macrolactin)、脂肽類化合物(bacillomycin D、fengycin、durfactin)及多肽類化合物(plantazolicin、amylocyclicin)等?；蚪M測序結(jié)果分析顯示，F(xiàn)ZB42含有11個與次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因簇，能夠通過非核糖體途徑及核糖體途徑合成脂肽及聚酮類抑菌活性物質(zhì)[13-15]。

本研究以松樹枯梢病的生物防治為切入點，證實瓦雷茲芽孢桿菌FZB42可在體外有效抑制松樹枯梢病原菌松杉球殼孢的生長。為確定FZB42的抑菌活性物質(zhì)，以FZB42 Landy培養(yǎng)基發(fā)酵液為研究對象，利用硫酸銨沉淀法分離發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)并對其抑菌活性進行了測定。結(jié)果表明，F(xiàn)ZB42發(fā)酵液中抑制松杉球殼孢生長的活性物質(zhì)為肽類物質(zhì)。目前，F(xiàn)ZB42抑菌活性物質(zhì)的研究主要集中于脂肽化合物的抑菌活性及機理研究。Gu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZB42產(chǎn)生的bacillomycin D可引起禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)細胞質(zhì)膜和細胞壁的形態(tài)學(xué)改變，誘導(dǎo)菌體孢內(nèi)活性氧累積，最終導(dǎo)致菌絲和孢子死亡，而脂肽類化合物表面活性肽能夠破壞或者溶解細胞膜，從而抑制菌體生長。然而，在本研究中，通過鹽析法從FZB42 Landy培養(yǎng)基發(fā)酵液中分離獲得粗提蛋白(分子質(zhì)量>10 ku)，并對其抑菌活性進行測定，證實該蛋白粗提物對松杉球殼孢具有良好的抑菌活性。在后續(xù)試驗中，利用胃蛋白酶水解上述蛋白粗提物并對其抑菌活性進行測定，其抑菌活性顯著下降，證實FZB42發(fā)酵液中抑制松杉球殼孢生長的物質(zhì)確為蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)，但其結(jié)構(gòu)及氨基酸組成需要通過構(gòu)建突變株，破壞FZB42的多肽類次生代謝物plantazolicin、amylocyclicin等的合成途徑，來判斷探究對病原菌松杉球殼孢的抑制作用的貢獻者，進一步研究。

生防菌的定殖能力是影響其生防作用發(fā)揮的關(guān)鍵因素，生防菌生物膜的形成能力與其定殖能力密切相關(guān)[16-18]。生物膜是指細菌通過分泌多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)以連結(jié)細菌群體而形成的具有黏附性有組織的膜狀結(jié)構(gòu)[19-21]。生物膜能將細胞與細胞緊密連結(jié)起來，提高彼此之間的基因轉(zhuǎn)移與交換頻率，從而增強其環(huán)境適應(yīng)能力，增加種群多樣性。同時，生物膜也是影響細菌定殖能力的關(guān)鍵指標。大量研究表明，細菌的生物膜形成能力與其在寄主植物上的聚集與附著密切相關(guān)，且生物膜的形成是一個連續(xù)的過程。細菌在物體表面的初始黏附是影響生物膜形成的關(guān)鍵因素，且細菌本身的特性及及鞭毛等結(jié)構(gòu)均會影響菌體生物膜的形成。此外，在細菌生物膜的發(fā)育過程中，菌體的運動性也發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，瓦雷茲芽孢桿菌FZB42可在培養(yǎng)液的表面與培養(yǎng)板的壁上形成生物膜。運動性測定試驗證明FZB42具有較強的運動能力，這與其生物膜的形成具有密切的關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究從松杉球殼孢的生物防治入手，探索瓦雷茲芽孢桿菌FZB42對松杉球殼孢的抑菌活性，得到如下結(jié)論：瓦雷茲芽孢桿菌FZB42在體外可顯著抑制松杉球殼孢生長，其Landy培養(yǎng)基發(fā)酵液對松杉球殼孢的抑菌率為96.1%。瓦雷茲芽孢桿菌FZB42 Landy培養(yǎng)基中的有效抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)，且其分子質(zhì)量大于10 ku瓦雷茲芽孢桿菌FZB42具有較強的生物膜形成能力及運動能力，具有良好的定殖潛力。