和偉程，石曉玲，李 菊，張瀟文，劉方程，李瓊毅，柏家林,*

(1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院；3.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院)

小反芻獸疫 (PPR)是由小反芻獸疫病毒 (PPRV)引起的一種急性、主要感染小反芻動(dòng)物綿、山羊的傳染病。PPR因其發(fā)病率、死亡率高，給養(yǎng)羊業(yè)帶來嚴(yán)重危害。PPRV屬于副粘病毒科、麻疹病毒屬病毒，已被列入世界動(dòng)物衛(wèi)生組織應(yīng)報(bào)告的陸生動(dòng)物疾病清單。根據(jù)國際病毒分類學(xué)委員會(huì)的最新病毒分類法，該病毒已更名為小反芻動(dòng)物麻疹病毒 (SRMV)。麻疹病毒屬病毒有麻疹病毒(MeV)、牛瘟病毒(RPV)、小反芻獸疫病毒(PPRV)、犬瘟熱病毒(CDV)、海豹瘟熱病毒(PDV)、鯨類動(dòng)物麻疹病毒(CeMV)和貓科動(dòng)物麻疹病毒(FMV)7個(gè)成員，都有相似的基因組成。PPRV呈球形，有包膜，直徑為150～700 nm，病毒基因組約為16 kb的單股負(fù)鏈RNA?；蚪M從5'-3' 端由N、P、M、F、H和L 6個(gè)基因組成，分別編碼N、P、M、F、H和L 6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，參與構(gòu)成病毒粒子。此外，P基因還額外編碼兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白C和V，在病毒誘導(dǎo)宿主免疫功能抑制與疾病發(fā)生中起重要作用。也有研究表明非結(jié)構(gòu)蛋白還與病毒毒力有。

C蛋白和V蛋白是P基因的產(chǎn)物，通過RNA編輯從P蛋白轉(zhuǎn)錄單元中獲得，C蛋白分子量約20 kD，不發(fā)生磷酸化修飾。前期同屬病毒相關(guān)研究表明C蛋白與L蛋白可在高分子量聚集體中相互結(jié)合，促進(jìn)病毒RNA的合成，敲除C基因的重組麻疹病毒 (MV)不會(huì)在感染動(dòng)物中繁殖。但由于V和C缺陷病毒都能誘導(dǎo)高水平的中和抗體和強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，它們可以為免疫缺陷個(gè)體開發(fā)合適的疫苗。V蛋白分子量約32 kD，V蛋白需要磷酸化修飾，敲除V基因的MV可導(dǎo)致病毒RNA合成受阻和病毒效價(jià)降低，從而影響病毒毒力。研究表明C、V蛋白均參與I型干擾素應(yīng)答的初始階段，缺失C蛋白的重組MV在具有完整I型干擾素系統(tǒng)的細(xì)胞中復(fù)制緩慢，且突變型毒株感染細(xì)胞后I型干擾素的表達(dá)量顯著高于野生型，C蛋白缺失的仙臺(tái)病毒 (SeV)在感染期間可產(chǎn)生更多的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，進(jìn)而激活I(lǐng)FN-β啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)IFN-β的產(chǎn)生。反之，野生型病毒不產(chǎn)生dsRNA，對(duì)IFN-β的產(chǎn)生有抑制作用，但PPRV C蛋白在IFN-β誘導(dǎo)中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。副粘病毒V蛋白能通過結(jié)合黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5(MDA-5)或視黃酸誘導(dǎo)基因I (RIG-I)抑制IFN-β啟動(dòng)子的激活。PPRV V蛋白N端的110位酪氨酸能阻斷轉(zhuǎn)錄激活子1 (STAT1)的磷酸化并阻止其進(jìn)入細(xì)胞核，在阻斷IFN-β誘導(dǎo)的STAT1的活化中發(fā)揮重要作用，富含半胱氨酸的C端可以通過結(jié)合κB激酶a抑制劑 (IKKα)抑制IRF7的活性從而下調(diào)IFN-β的產(chǎn)生。

迄今為止，小反芻獸疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白C和V的研究相對(duì)較少，為進(jìn)一步研究其功能，本研究運(yùn)用PCR技術(shù)克隆了點(diǎn)突變的C和V基因，構(gòu)建了兩種突變基因真核表達(dá)載體p3Flag-CMV-14-ΔC和p3Flag-CMV-14-ΔV，通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞檢測(cè)了突變基因的表達(dá)，為進(jìn)一步C蛋白和V蛋白的功能提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚胎腎細(xì)胞(HEK-293T)由甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心提供；HEK-293T和Vero細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)；質(zhì)粒p3Flag-CMV-14-C、p3Flag-CMV-14-V及p3Flag-CMV-14由西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心提供。

1.2 試劑

Ex Taq DNA 聚合酶、Hind III、EcoR I、Kpn I購自大連寶生物公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司；凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；抗Flag標(biāo)簽抗體，抗β-actin抗體，山羊抗鼠抗體購自Sigma公司；胎牛血清、新生牛血清購自北京賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自蘭州民海生物工程有限公司；Power up SYBR Green master mix購自Applied Biosystems公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，Pierce增強(qiáng)ECL蛋白印跡化學(xué)發(fā)光底物購自ThermoFisher Scientific公司。

1.3 PPRV病毒突變基因擴(kuò)增

根據(jù)GeneBank登錄的PPRV Nigeria 75/1 C和V基因序列 (序列號(hào)為ADX95992.1和ADX95991)，設(shè)計(jì)C基因和V基因qPCR引物 (表1)。參照?qǐng)?bào)道設(shè)計(jì)突變基因ΔC和ΔV的PCR引物序列，ΔC基因5’端引入Hind III酶切位點(diǎn)，3'引入Kpn I酶切位點(diǎn)；ΔV基因5'引入Hind III酶切位點(diǎn)，3'端引入EcoR I酶切位點(diǎn)(表1)。ΔC基因：起始密碼子AUG突變?yōu)锳CG，并在氨基酸序列的第9位、第12位引入終止密碼子(圖1A)。ΔV基因：在氨基酸序列的第7位、第285位、第294位引入三個(gè)終止密碼子(圖1B)。以p3Flag-CMV-14-C和p3Flag-CMV-14-V質(zhì)粒DNA為模板擴(kuò)增ΔC和ΔV基因。引物由生工生物工程 (上海)有限公司合成。以p3Flag-CMV-14-C、p3Flag-CMV-14-V質(zhì)粒為模板擴(kuò)增ΔC和ΔV基因，PCR反應(yīng)體系為50 μL：Ex Taq Buffer 5 μL，Ex Taq 0.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，上下游引物各 1 μL，模板 2 μL，補(bǔ)加 ddH2O 至 50 μL。PCR反應(yīng)程序：35 個(gè)循環(huán)，98 ℃ 5 min ，95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min。配制1.2%的核酸膠，并進(jìn)行膠回收。

表1 PCR和qPCR引物的核苷酸序列

圖1 PPRV病毒ΔC基因 (A)和ΔV(B)基因突變策略

1.4 突變基因重組表達(dá)載體構(gòu)建

用Hind III和Kpn I，Hind III和EcoR I 分別雙酶切p3Flag-CMV-14和ΔC，p3Flag-CMV-14和ΔV基因片段，T4DNA連接酶將目的基因連于載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體p3Flag-CMV-14-ΔC和p3Flag-CMV-14-ΔV，進(jìn)行雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 突變基因的表達(dá)

1.5.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞 將HEK-293T細(xì)胞 (2×105)接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至70%～90%匯合時(shí)，按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書每孔分別轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14-ΔC (2.5 μg)、p3Flag-CMV-14-ΔV (2.5 μg)、p3Flag-CMV-14-C (2.5 μg)、p3Flag-CMV-14-V (2.5 μg)和p3Flag-CMV-14 (2.5 μg)。轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞，分別提取RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行RT-qPCR和Western blot檢測(cè)。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 使用RNA提取試劑盒提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒操作說明進(jìn)行ΔC和ΔV基因表達(dá)測(cè)定。qPCR反應(yīng)體積20 μL：Power up SYBR Green master mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL, ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為：95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、34 s，72℃、1 min，40個(gè)循環(huán)，在熒光定量PCR儀(Life Technologies Holdings Pte Ltd, The United States of America)進(jìn)行擴(kuò)增并分析結(jié)果。

1.5.3 蛋白質(zhì)印跡(Western blot) 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液(RIPA)與蛋白酶抑制劑(PMSF)進(jìn)行裂解，加上樣緩沖液處理，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白移到PVDF膜上，用2.5%脫脂奶粉液封閉1 h，加1∶2 000稀釋的鼠抗Flag抗體孵育2 h，PBST洗6次，加帶有HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育1 h，PBST洗滌5次，用去離子水終止反應(yīng)，Pierce增強(qiáng)ECL蛋白印跡化學(xué)發(fā)光底物觀察結(jié)果。使用β-Actin作為內(nèi)參蛋白。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用Graphpad Prism 7 (San Diego, CA, USA)對(duì)結(jié)果進(jìn)行Student’s t-test統(tǒng)計(jì)分析。每組數(shù)據(jù)用mean ± SEM表示，至少設(shè)置三個(gè)重復(fù)。兩組間P<0.05表示差異顯著用“*”表示，P< 0.01和P<0.001表示差異極顯著，分別用“**”和“***”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPRV突變基因ΔC和ΔV的擴(kuò)增

根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物ΔC-F和ΔC-R, ΔV-F和ΔV-R分別從p3Flag-CMV-14-C和p3Flag-CMV-14-V質(zhì)粒擴(kuò)增獲得大小約為533 bp的PPRV病毒突變基因ΔC和896 bp的PPRV病毒突變基因ΔV片段，其大小與預(yù)期基因片段一致 (圖2)。

圖2 PPRV突變基因 ΔC和ΔV 片段PCR擴(kuò)增電泳

2.2 突變基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將擴(kuò)增獲得ΔC和ΔV的產(chǎn)物與p3Flag-CMV-14載體連接后得到重組質(zhì)粒p3Flag-CMV-14-ΔC和p3Flag-CMV-14-ΔV。經(jīng)Hind III與Kpn I、Hind III與EcoR I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分別得到約533 bp的ΔC和896 bp的 ΔV基因條帶，以及約6 310 bp載體骨架條帶 (圖3)，其結(jié)果與預(yù)期大小一致。測(cè)序表明，重組表達(dá)質(zhì)粒中ΔC和ΔV基因序列與其設(shè)計(jì)模板序列 (包括突變堿基)同源性分別為99.8%和100%。除了引入的突變位點(diǎn)外，p3Flag-CMV-14-ΔC中ΔC序列的第123位發(fā)生單堿其突變A123G，但其編碼氨基酸未改變，均為精氨酸，對(duì)后期表達(dá)無影響(圖4)。

圖3 重組質(zhì)粒pFlag-CMV-ΔC和pFlag-CMV-ΔV

圖4 重組質(zhì)粒p3Flag-CMV-14-ΔC測(cè)序鑒定

2.3 突變基因表達(dá)檢測(cè)

6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)HEK-293T細(xì)胞至70%～90%匯合時(shí)，Lipofectamine 2000每孔分別轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14-ΔC (2.5 μg)、p3Flag-CMV-14-ΔV (2.5 μg)和p3Flag-CMV-14 (2.5 μg)。轉(zhuǎn)染24 h后，轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14和p3Flag-CMV-14-ΔC質(zhì)粒細(xì)胞C基因表達(dá)極顯著低于轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14-C細(xì)胞(P<0.001)，p3Flag-CMV-14和p3Flag-CMV-14-ΔC轉(zhuǎn)染細(xì)胞中C基因幾乎無表達(dá)，差異不顯著(P>0.05)(圖5A)。Western blotting檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14-ΔC細(xì)胞中C蛋白也無表達(dá)(圖5B)。結(jié)果表明通過PCR突變技術(shù)獲得了表達(dá)沉默的C基因。同樣，轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14和p3Flag-CMV-14-ΔV質(zhì)粒細(xì)胞V基因表達(dá)極顯著低于轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14-V細(xì)胞(P<0.01)，p3Flag-CMV-14-ΔV轉(zhuǎn)染細(xì)胞中V基因雖然有表達(dá)，但表達(dá)量不高，與轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14細(xì)胞V基因表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)(圖6A)。Western blotting檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染p3Flag-CMV-14-ΔV細(xì)胞中V蛋白也無表達(dá)(圖6B)。結(jié)果表明通過PCR突變技術(shù)獲得了表達(dá)沉默的V基因。

圖5 C基因和C蛋白在HEK-293T細(xì)胞中表達(dá)

圖6 V基因和V蛋白在HEK-293T細(xì)胞中表達(dá)

3 討論

在全球牛瘟根除計(jì)劃(GREP)成功實(shí)施后，國際獸疫局(OIE)已開始采取多種措施控制PPRV的傳播。自2007年我國西藏首次出現(xiàn)PPR病例以來，該病不斷向其他地區(qū)擴(kuò)散，其發(fā)病率逐年上升，對(duì)我國養(yǎng)羊業(yè)和野生動(dòng)物造成巨大的危害。目前該病治療方法有限，主要依靠接種疫苗進(jìn)行預(yù)防。

與所有副粘病毒一樣，PPRV基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白C是從P基因前半部分開放閱讀框的第二個(gè)ATG開始編碼的表達(dá)蛋白。C蛋白分子量約20 KDa，無磷酸化，與L蛋白結(jié)合，定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)。C蛋白在免疫逃逸和疾病發(fā)生中有不同的作用。副粘病毒科病毒中，C蛋白主要通過兩種機(jī)制抑制IFN產(chǎn)生，一種是C蛋白減少病毒復(fù)制，因此減少了PRRs可以識(shí)別的基因基序的數(shù)量，從而降低了IFNs的產(chǎn)生；另一種是C蛋白直接干擾PRRs信號(hào)通路，影響IFN基因的轉(zhuǎn)錄。PRRs信號(hào)中，MeV-C、RPV-C蛋白的靶標(biāo)已被識(shí)別，但PPRV-C蛋白靶標(biāo)未見報(bào)道。盡管確切機(jī)制仍不清楚，但MeV-C、RPV-C蛋白作用于細(xì)胞核中IRF3，干擾了IRF3的轉(zhuǎn)錄而不影響其磷酸化、二聚化或核積聚，從而阻斷IFN-I的生成，其作用機(jī)理是IRF3二聚體位阻了IFN-β啟動(dòng)子。MeV-C蛋白還能阻斷NF-κB信號(hào)通路，但比V蛋白弱，表明副粘病毒C蛋白可能還存在其它機(jī)制抑制宿主免疫反應(yīng)。雖然V蛋白可能是MeV感染過程中IFN信號(hào)的主要拮抗劑，也有報(bào)道C蛋白也能阻斷IFN-I信號(hào)通路?？傊?，副粘病毒科病毒C蛋白抑制干擾素誘導(dǎo)的信號(hào)通路是天然免疫啟動(dòng)上的一個(gè)必要組成部分，如MeV-、RPV-C蛋白一樣，PPRV C蛋白是否影響PRRs通路是將來研究重點(diǎn)，對(duì)闡明PPRV免疫抑制機(jī)理具有重要意義。

麻疹病毒屬病毒P基因通過其開放閱讀框移碼的特殊編輯策略，在保守的RNA編輯位點(diǎn)5'-TTAAAAGGGCACAG-3'插入一個(gè)G或兩個(gè)G產(chǎn)生V蛋白或W蛋白，該位點(diǎn)沒有堿基插入時(shí)合成P蛋白，V蛋白是麻疹病毒屬病毒的毒力因子。與其他病毒P、V、W蛋白一樣，PPRV V蛋白含有氨基端結(jié)構(gòu)域，但氨基酸序列同源性不高；羧基端有富含組氨酸和半胱氨酸的鋅指結(jié)構(gòu)，氨基酸序列同源性高。副粘病毒科呼吸病毒屬、亨尼病毒屬、輪狀病毒屬和麻疹病毒屬病毒編碼的V蛋白分子量28-32 KDa，被磷酸化后與N、L蛋白結(jié)合在一起，均可產(chǎn)生IFN信號(hào)逃逸。與其他副粘病毒科病毒一樣，麻疹病毒屬病毒V蛋白可在IFN-I信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的不同階段均可產(chǎn)生干擾作用，阻斷干擾素信號(hào)，抑制細(xì)胞的抗病毒作用。PPRV V蛋白通過與STAT1和STAT2互作抑制IFN信號(hào)通路，介導(dǎo)天然免疫逃逸。PPRV V蛋白對(duì)ISRE和GAS啟動(dòng)子表達(dá)的抑制作用比N和P蛋白強(qiáng)烈，其氨基端結(jié)構(gòu)域第101位酪氨酸突變?yōu)楸彼崮軠p弱IFN信號(hào)通路的抑制，表明這一結(jié)構(gòu)域的功能是拮抗IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，羧基端結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)中的保守半胱氨酸簇和色氨酸基序與STAT2也有互作，其中第275和第277兩個(gè)氨基酸發(fā)揮重要作用。麻疹病毒屬病毒V蛋白不僅與STAT1和STAT2作用，還能干擾其上游Jak家族蛋白質(zhì)的磷酸化，MeV、CDV、RPV和PPRV病毒的V蛋白能抑制Tyk2磷酸化，但只有強(qiáng)毒RPV的V蛋白才能破壞Jak1的磷酸化。在這些實(shí)驗(yàn)中，所有V蛋白都能免疫共沉淀Jak1和Tyk2，而不影響其磷酸化，表明V蛋白可能結(jié)合于IFNR受體的Jak1/Tyk2復(fù)合體，然后破壞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種輔助的IFN-I抑制機(jī)制表明麻疹病毒可能有幾條途徑阻斷IFN-I和IFN-II信號(hào)通路，提示了這一途徑在該屬病毒致病性上具有重要作用。

很少有研究關(guān)注PPRV、RPV病毒V蛋白抑制IFN產(chǎn)生路徑或與RLR的互作。至少有13種副粘病毒V蛋白能與MDA5結(jié)合從而抑制IFN產(chǎn)生。已證實(shí)MeV-V蛋白羧基端結(jié)構(gòu)域與MDA-5結(jié)合，該結(jié)構(gòu)域還與LGP2相互作用，而不是與RIG-I直接作用抑制它的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。MeV-V蛋白還能干擾其他PRRs誘導(dǎo)的信號(hào)通路，如抑制漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞中TLR7/9誘導(dǎo)的IFN產(chǎn)生；與IKKɑ互作阻礙IRF7激活，進(jìn)而影響IFN-β生成；抑制NF-κB活性等。雖然RPV、PPRV病毒V蛋白與RLR或TLR信號(hào)通路接頭蛋白的互作還沒有更多研究，但研究表明RPV病毒通過C蛋白抑制MDA-5信號(hào)而不是V蛋白。盡管如此，PPRV-V蛋白能夠抑制IFN-β啟動(dòng)子活性，表明RPV-和PPRV-V蛋白作用不完全一樣。PPRV-V蛋白是否與MeV蛋白作用靶點(diǎn)相同仍有待研究。與其他麻疹病毒一樣，PPRV-V蛋白通過削弱IFN-I和IFN-II信號(hào)、阻止IFN產(chǎn)生而在抑制細(xì)胞的抗病毒作用中發(fā)揮必要作用。

本研究將PPRV C基因起始密碼子AUG突變?yōu)锳CG，并在氨基酸序列的第9位、第12位引入終止密碼子，在V基因編碼氨基酸序列的第7位、第285位、第294位引入三個(gè)終止密碼子，運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得了表達(dá)沉默的突變基因ΔC和ΔV，構(gòu)建了真核表達(dá)載體p3flag-CMV-14-ΔC和p3flag-CMV-14-ΔV。實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染突變基因質(zhì)粒HEK-293T細(xì)胞中C基因和V 基因表達(dá)均極顯著降低, 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染突變基因質(zhì)粒細(xì)胞中C蛋白和V蛋白均無表達(dá)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究PPRV病毒C和V蛋白的功能提供了科學(xué)依據(jù)。