高 松，陳安林，黃 健，喻安永，夏靈尹，閔 迅

(1. 遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科，貴州 遵義 560003； 2. 遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院急診科，貴州 遵義 560003； 3. 遵義醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院，貴州 遵義 563000)

創(chuàng)口鮑特菌(Bordetellatrematum)屬于鮑特菌屬，是一種革蘭陰性短小桿菌。鮑特菌屬包含的種類較多，其中最常見的是百日咳鮑特菌和副百日咳鮑特菌[1]。創(chuàng)口鮑特菌為專性需氧菌，營養(yǎng)要求不高，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長良好。Vandamme等[2]在1996年首次報道創(chuàng)口鮑特菌，并將其歸類為鮑特菌屬細菌中的一種。作為條件致病菌，其廣泛存在于自然環(huán)境中。創(chuàng)口鮑特菌主要引起創(chuàng)面皮膚和軟組織感染，也有報道從患者下呼吸道、耳分泌物和血液中分離到此菌。若治療不及時，可引起嚴重的血流感染，導致膿毒血癥，威脅患者生命[3]。目前，國內(nèi)尚無關(guān)于創(chuàng)口鮑特菌感染的病例報道。1例上肢外傷患者傷口分泌物分離菌株，經(jīng)生化鑒定、質(zhì)譜鑒定，以及16S rRNA基因序列分析鑒定為創(chuàng)口鮑特菌，現(xiàn)將其臨床特點和微生物特征報告如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、VITEK MS全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)、陽性球菌鑒定卡、CHCA基質(zhì)液均購自法國生物梅里埃公司,快速革蘭染色液購自珠海貝索公司，血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基均購自貝瑞特公司，細菌基因組提取試劑盒購自北京天根公司，PCR擴增試劑、DNA Maker購自TaKaRa公司(上海生物技術(shù)股份有限公司),16S rRNA引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng) 無菌棉拭子蘸取患者創(chuàng)面分泌物，采用分區(qū)劃線法接種于血平板和麥康凱平板。置于36℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，觀察細菌生長情況。

1.2.2 顯微鏡觀察 挑取適量單個菌落，與適量生理鹽水在載玻片上混勻，制成涂片，革蘭染色后油鏡觀察。

1.2.3 生化鑒定 挑取麥康凱平板上單個純菌落，制成0.5麥氏單位的菌懸液。選擇革蘭陰性桿菌鑒定卡(GN),根據(jù)全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK 2 Compact操作說明書進行上機鑒定。

1.2.4 質(zhì)譜鑒定 取適量待測菌均勻涂抹于全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)VITEK MS配套靶板上，加1 μL的質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)液覆蓋菌膜，以大腸埃希菌E.coli8739為質(zhì)控菌株，待基質(zhì)液干燥后上機檢測。

1.2.5 分子生物學鑒定 使用全自動核酸提取儀制備細菌基因組DNA。采用16S rRNA通用引物正向引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物：ACGGCTACCTTGTTACGACTT進行PCR擴增。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物送上海生工生物公司進行測序，并在NCBI網(wǎng)站進行序列比對分析。

1.2.6 藥敏試驗 采用最低抑菌濃度(MIC)法進行藥物敏感性檢測。制備0.5麥氏單位菌懸液，根據(jù)革蘭陰性菌藥敏卡(GN09)要求進行稀釋，然后使用VITEK 2 Compact儀器進行藥敏試驗。試驗結(jié)果根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI) M100抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準2020版進行判讀。

2 結(jié)果

2.1 病例資料 患者，男性，44歲，既往身體健康。2020年8月因工作時被機器絞傷致右上肢疼痛、流血伴活動受限到遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院急診科就診，初步診斷為“右上肢機械性絞傷”。急救創(chuàng)傷病房住院，經(jīng)骨科醫(yī)生施行右肘關(guān)節(jié)脫位復位+右尺骨骨折克氏針內(nèi)固定術(shù)+右上肢外固定術(shù)，整形外科醫(yī)生施行右上肢擴創(chuàng)+血管、神經(jīng)探查+異物清除+得膜建覆蓋創(chuàng)面+手背擴創(chuàng)+VSD安置術(shù)。術(shù)后病情平穩(wěn)，囑患者帶外固定架出院休養(yǎng)，后期復查后再行后續(xù)治療。

2020年11月患者因“右上肢外固定術(shù)2+月，返院行內(nèi)固定術(shù)”。在全麻下行“右尺骨近端骨折切開復位內(nèi)固定術(shù)+尺橈關(guān)節(jié)畸形愈合松解術(shù)”，術(shù)后予以抗感染、補液、止痛、換藥、促進創(chuàng)面愈合等對癥治療。兩周后臨床醫(yī)生檢查發(fā)現(xiàn)其右上肢上段手術(shù)創(chuàng)面未愈合，手術(shù)創(chuàng)面紅腫并且覆著膿性分泌物?；颊咦栽V術(shù)區(qū)疼痛，偶感惡心、嘔吐，無畏寒及發(fā)熱，無胸悶、氣促及呼吸困難，精神、飲食及睡眠可，大小便正常。實驗室檢查結(jié)果：血常規(guī)檢查白細胞和血小板計數(shù)正常，紅細胞4.03×1012/L,血紅蛋白110 g/L,白細胞介素-6 82.5 pg/mL,降鈣素原(PCT) 0.45 ng/mL、C-反應蛋白(CRP) 36.2 mg/L，結(jié)果均提示患者可能并發(fā)術(shù)后感染。經(jīng)兩次引流、清創(chuàng),以及更換抗生素抗感染治療，手術(shù)創(chuàng)面逐漸好轉(zhuǎn)后出院，但仍有少許滲出，囑患者院外加強換藥。

2.2 微生物學檢查

2.2.1 菌落特征及鏡下形態(tài) 患者創(chuàng)面分泌物培養(yǎng)24 h后，觀察發(fā)現(xiàn)血瓊脂培養(yǎng)基上有圓形、干燥、粗糙大小不等的乳白色菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上有淡粉紅色、點狀、干燥、針尖樣大小的菌落。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后觀察發(fā)現(xiàn)血平板上的菌落呈扁平、干燥、表面粗糙、不規(guī)則、較大的乳白色菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上長成較小的淡粉紅色、圓形菌落。見圖1。革蘭染色，油鏡下觀察見革蘭陰性桿菌，中等大小。見圖2。

2.2.2 生化鑒定 采用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)及其配套GN鑒定卡對細菌進行全面生化鑒定，見表1。經(jīng)VITEK 2 Compact AES高級專家系統(tǒng)進行比對，鑒定結(jié)果為鮑特菌屬(置信度為97%)。

表1 患者創(chuàng)面分泌物分離細菌VITEK 2 Compact生化試驗鑒定結(jié)果

2.2.3 質(zhì)譜鑒定 VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)未能將此菌鑒定到種，進一步采用微生物質(zhì)譜儀進行鑒定。經(jīng)VITEK MS鑒定結(jié)果為創(chuàng)口鮑特菌(置信度為99.9%),其在2 066、4 329、5 209、5 249、6 304、6 713 M/z處有特征峰譜，見圖3。

2.2.4 16S rRNA鑒定 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測確證擴增成功，PCR擴增產(chǎn)物長度為1 500 bp。將擴增產(chǎn)物送測序，測序結(jié)果進行BLAST比對分析。比對發(fā)現(xiàn)其與創(chuàng)口鮑特菌的同源性為99.9%。見圖4。

表2 創(chuàng)口鮑特菌對常用抗菌藥物的藥敏結(jié)果

3 討論

鮑特菌屬包含多個菌種，最常見的是百日咳鮑特菌和副百日咳鮑特菌。創(chuàng)口鮑特菌感染在臨床上極為少見，主要見于創(chuàng)面感染，尤其是經(jīng)久不愈的傷口或潰瘍。查閱文獻發(fā)現(xiàn)最近幾年也有少量的文獻報道。2020年Kukla等[4]報道在1例肺癌患者的呼吸道標本中分離鑒定出1株創(chuàng)口鮑特菌。2019年Castro等[5]報道在1例74歲女性患者的腿部潰瘍和壞疽組織中分離培養(yǎng)出創(chuàng)口鮑特菌。此外，2016年Majewski等[3]在膿毒癥患者血液中分離鑒定出創(chuàng)口鮑特菌，說明此菌不僅可以引起創(chuàng)面感染和呼吸道感染，而且還可進入血流，引起膿毒血癥。由于創(chuàng)面感染通常比較復雜，混合感染較為常見，?；祀s其他細菌，而且創(chuàng)口鮑特菌生長較為緩慢，很容易被其他細菌生長所掩蓋，不易發(fā)現(xiàn)。本研究從1例手部創(chuàng)傷患者的創(chuàng)面分泌物中培養(yǎng)出創(chuàng)口鮑特菌，且培養(yǎng)物較純，推測本例中分離到的創(chuàng)口鮑特菌可能具有一定的臨床意義，提示在實驗室分離到類似的少見菌，需要結(jié)合臨床，以及流行病學和實驗室檢測情況進行綜合分析。

根據(jù)細菌在血平板和麥康凱平板都生長的特點，初步判斷是革蘭陰性桿菌，革蘭染色證實該結(jié)果。細菌菌落形態(tài)較為特別，與常見的革蘭陰性桿菌有很大的區(qū)別，氧化酶試驗結(jié)果顯示為陽性。但也有文獻報道氧化酶試驗是陰性，其分析可能是檢測方法不一樣所致[6]。因此，此菌的氧化酶試驗有待進一步確定，通過生化反應的差異鑒定細菌是目前的主要方法。明確該菌為革蘭陰性桿菌后，研究人員立即采用梅里埃公司的革蘭陰性菌鑒定卡對該菌進行系統(tǒng)生化鑒定，鑒定結(jié)果為鮑特菌屬(置信度97%)。查閱具體生化反應，發(fā)現(xiàn)該菌只有5個生化項目為陽性反應，說明該菌生化反應并不活潑，有可能鑒定不準確，并且未能鑒定到具體的菌種水平，因此還需采用其他更好的檢測方法進行鑒定。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是目前廣泛用于微生物鑒定的一種快速、可靠的檢測方法。Almagro-Molto等[7]研究發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOF MS可用于創(chuàng)口鮑特菌的鑒定。通過質(zhì)譜鑒定出該菌為創(chuàng)口鮑特菌，其置信度高達99.9%。為進一步確保鑒定結(jié)果準確無誤，采取目前細菌鑒定準確度最高的分子生物學檢測技術(shù)對該菌進行鑒定和分析[8]。對該致病菌進行16S rRNA的PCR擴增及產(chǎn)物測序，經(jīng)同源性分析，BLAST比對結(jié)果顯示其與創(chuàng)口鮑特菌的同源性為99.9%，確定鑒定結(jié)果是創(chuàng)口鮑特菌。在臨床工作中，遇到類似具有重要臨床意義的少見菌時，應充分利用目前的先進檢測技術(shù)，采用多種方法進行鑒定，確保結(jié)果準確無誤。

由于創(chuàng)口鮑特菌的感染主要發(fā)生在創(chuàng)面，臨床醫(yī)生通常會首先實施清創(chuàng)術(shù)，再配合使用抗菌藥物，以最大程度地減少感染的發(fā)生。合理的選擇抗菌藥物對預防創(chuàng)口鮑特菌感染十分重要。根據(jù)相關(guān)研究文獻報道，創(chuàng)口鮑特菌感染可常規(guī)使用環(huán)丙沙星和頭孢菌素。但研究[9-10]報道，已出現(xiàn)對頭孢他啶和環(huán)丙沙星耐藥的菌株。目前，CLSI并無針對創(chuàng)口鮑特菌的藥敏判斷折點，通常是按照腸桿菌目細菌的折點進行藥敏結(jié)果的判斷。本例中藥敏試驗結(jié)果顯示該菌對頭孢菌素均為耐藥，僅對亞胺培南、美羅培南和阿米卡星等少數(shù)藥物敏感，表明創(chuàng)口鮑特菌的耐藥性在逐漸發(fā)生變化。因此，臨床實驗室需要常規(guī)開展對該菌的藥敏試驗，加強對該菌的耐藥性監(jiān)測。

綜上所述，目前國內(nèi)尚未見創(chuàng)面創(chuàng)口鮑特菌感染病例報道，結(jié)合近年來國外多例報道，提示臨床需重視創(chuàng)口鮑特菌感染，如果得不到及時控制，可能會引起膿毒血癥，危及患者生命。在實驗室鑒定方面，由于創(chuàng)口鮑特菌菌落形態(tài)特殊，且生化反應不活潑，臨床實驗室若分離到可疑菌株，應及時采用質(zhì)譜鑒定或16S rRNA測序鑒定，以快速、準確獲得結(jié)果，并進行藥敏試驗，指導臨床用藥。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。