趙 璐，張慧玲，劉佳雯，達(dá) 哇，張永棟

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院 1. 公共衛(wèi)生和醫(yī)院感染管理部； 2. 血液透析中心，青海 西寧 810001)

透析用水易受微生物污染，常見(jiàn)為革蘭陰性桿菌。革蘭陰性桿菌死亡后會(huì)產(chǎn)生、釋放內(nèi)毒素，機(jī)體反復(fù)暴露于內(nèi)毒素會(huì)誘發(fā)炎癥反應(yīng)，其特征是脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致血透患者機(jī)體長(zhǎng)期受到慢性炎癥等影響[1-2]。近年來(lái)很多研究通過(guò)改進(jìn)透析器膜，解決患者感染風(fēng)險(xiǎn)，如國(guó)外開(kāi)發(fā)由聚醚砜、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和活性炭組成的混合基質(zhì)膜(MMM)，體外試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)細(xì)菌過(guò)濾效果優(yōu)良[3]。而透析用水的質(zhì)量才是杜絕細(xì)菌熱原污染的根源所在。透析用水消毒方式以熱消毒和化學(xué)消毒為主。熱消毒通過(guò)短時(shí)間將水溫提高并進(jìn)行熱沖洗，達(dá)到恒溫后熱循環(huán)在管路中達(dá)到消毒作用，而化學(xué)消毒主要使用過(guò)氧乙酸等消毒劑，有效阻止細(xì)菌在水中增殖生長(zhǎng)[4-5]。雖然消毒可以有效阻菌，但是不能徹底消滅透析用水水路中的微生物及相關(guān)物質(zhì)，如洋蔥伯克霍爾德菌易在供水系統(tǒng)、濾膜和消毒劑中生長(zhǎng)[6]。同時(shí)日常監(jiān)測(cè)僅定期監(jiān)測(cè)透析用水的污染情況，相關(guān)規(guī)范對(duì)于透析水路管理中細(xì)菌及內(nèi)毒素均有采樣檢測(cè)時(shí)間和限值要求。但不同消毒模式下透析用水中細(xì)菌和內(nèi)毒素含量動(dòng)態(tài)變化缺少監(jiān)測(cè)和分析。

本研究基于水路消毒系統(tǒng)模式下不同的物理參數(shù)及溫度，確定透析用水動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的溫度和時(shí)間間隔。預(yù)測(cè)微生物學(xué)是一門交叉學(xué)科，利用微生物和計(jì)算機(jī)方法預(yù)測(cè)微生物在系列環(huán)境條件中消長(zhǎng)的情況。通過(guò)Origin軟件的數(shù)據(jù)擬合，應(yīng)用微生物模型曲線描述透析用水微生物指標(biāo)存活和變化規(guī)律[7]，了解透析用水中細(xì)菌和內(nèi)毒素含量在消毒過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化和持續(xù)情況，旨在細(xì)化消毒監(jiān)測(cè)管理，優(yōu)化水質(zhì)安全控制。

1 材料與方法

1.1 材料 封閉式薄膜過(guò)濾器，硝酸纖維素濾膜(孔徑0.22 μm，直徑50 mm)， 胰化蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(TGEA)(HBPM8573-1，規(guī)格9 cm×10 cm)，BIOBASE多功能恒溫箱(型號(hào)BJPX-100)，革蘭陰性菌脂多糖檢測(cè)試劑盒(喜諾生物醫(yī)藥)(EKT-13M、25M)，細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀(IGL-800)，一次性無(wú)熱原采樣試管(PSB210104，規(guī)格：9 mm×65 mm)，鱟試劑(喜諾生物醫(yī)藥)，脂多糖標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于SIGMA-ALDRICH，成份LPS fromEscherichiacoliO111∶B4，蛋白含量小于3%)。

1.2 水樣采集方法

1.2.1 采樣點(diǎn) 透析用水采樣點(diǎn)為回水口(輸水管路末端)或混合室入口處(透析機(jī)與輸水回路連接部位U型采樣口)。因熱消毒的加熱和PHD循環(huán)程序、化學(xué)消毒的消毒劑浸泡程序運(yùn)行時(shí)回水口閥門關(guān)閉，兩個(gè)消毒程序過(guò)程均采集了整個(gè)輸水管路三個(gè)不同部位的混合室入口處，即首機(jī)(使用頻率低的1床過(guò)渡透析機(jī))、中間機(jī)(管路中間并第二個(gè)加熱組件部位對(duì)應(yīng)透析機(jī)位)、尾機(jī)(最后一臺(tái)透析機(jī)),見(jiàn)圖1。

1.2.2 采樣方法 用75%乙醇棉簽先消毒采樣口內(nèi)外表面后放水60 s，采集至無(wú)菌無(wú)熱源容器中，過(guò)程遵循無(wú)菌操作原則。每份供試液水樣采集80 mL，所需用量細(xì)菌培養(yǎng)50 mL，內(nèi)毒素測(cè)定10 mL。

1.3 采樣時(shí)機(jī) (1)熱消毒程序前管路的基礎(chǔ)情況、熱消毒程序(程序啟動(dòng)開(kāi)始、加熱升溫沖洗、PHD熱循環(huán)、冷卻排放、系統(tǒng)關(guān)閉)、持續(xù)消毒完成后共20 h。熱消毒設(shè)備在加熱期間管路的不同位置有熱敏顯示器監(jiān)測(cè)水溫，初始水溫作為動(dòng)態(tài)溫度的起始點(diǎn)20℃，采樣溫度為20～90℃，每間隔10℃。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)采集、檢測(cè)同采樣點(diǎn)同溫條件下3個(gè)單獨(dú)水樣(n=9)，試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算取平均值。(2)化學(xué)消毒程序前管路的基礎(chǔ)情況、化學(xué)消毒程序(程序啟動(dòng)開(kāi)始、沖洗加入消毒劑、循環(huán)、浸泡、沖洗、反復(fù)沖洗、系統(tǒng)關(guān)閉)、持續(xù)消毒完成后共20 h。水溫基本穩(wěn)定17～20℃，采樣時(shí)間為0～195 min，每間隔15 min。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)采集檢測(cè)同采樣點(diǎn)同時(shí)間點(diǎn)3個(gè)單獨(dú)水樣(n=9)，試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算取平均值。

1.4 細(xì)菌培養(yǎng)方法 參照YY 0572—2015標(biāo)準(zhǔn)，采用濾膜過(guò)濾法富集，水樣取量50 mL，富集在濾膜上。富集時(shí)保持液體全部覆蓋濾膜表面，過(guò)程中保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性，避免污染，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。將濾膜放在TGEA培養(yǎng)皿上20℃恒溫培養(yǎng)7 d后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，單位為CFU/mL[8]。

1.5 內(nèi)毒素測(cè)定 依據(jù)《中國(guó)藥典》動(dòng)態(tài)比濁細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度或透光率所需要的反應(yīng)時(shí)間，可準(zhǔn)確測(cè)定透析用水中細(xì)菌內(nèi)毒素含量。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶解稀釋建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及可靠性試驗(yàn)，將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品用純水溶解，稀釋成5個(gè)不同濃度，消除干擾，用真菌/細(xì)菌動(dòng)態(tài)檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，以稀釋度為自變量，以每個(gè)濃度測(cè)定結(jié)果均值為因變量繪制工作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回收率為75%～125%。

1.6 數(shù)據(jù)擬合分析 通過(guò)Origin(2017版)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)模型擬合，兩種消毒模式下不同時(shí)間或溫度下細(xì)菌含量變化使用logistic模型擬合，logistic模型是典型的預(yù)測(cè)模型，描述微生物數(shù)量隨著時(shí)間變化的情況[9]。用于微生物生長(zhǎng)和失活情況擬合效果良好。采用細(xì)菌存活率描述透析用水中細(xì)菌含量變化[10]，計(jì)算公式如下：ηh=Nt/N0(ηh細(xì)菌的存活率，Nt為不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的水中細(xì)菌含量，N0為消毒前初始水中細(xì)菌含量)，對(duì)存活率與各時(shí)間進(jìn)行對(duì)數(shù)非線性logistic模型擬合。不同消毒模式下內(nèi)毒素隨著時(shí)間或溫度變化的情況使用高斯(Gauss)函數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合。

2 結(jié) 果

2.1 兩種消毒模式下透析用水中細(xì)菌存活率對(duì)數(shù)與觀察時(shí)間關(guān)系 消毒前透析用水中細(xì)菌初始含量：熱消毒、化學(xué)消毒分別為2.46、3.06 CFU/mL。兩種消毒模式觀察時(shí)間均選擇為180 min。消毒處理對(duì)透析用水中細(xì)菌存活影響顯著，兩種消毒模式細(xì)菌存活率對(duì)數(shù)與消毒程序時(shí)間的關(guān)系呈現(xiàn)相似曲線特征，細(xì)菌存活率隨著消毒程序時(shí)間的增加而減少，在50～160 min時(shí)，細(xì)菌存活情況變化幅度大，熱消毒細(xì)菌含量減少的變化比化學(xué)消毒平緩，見(jiàn)圖2。

上述由logistic模型擬合結(jié)果的方程及其參數(shù)，方程為：

(1)

式中t為消毒處理時(shí)間(min)，A1、A2、t0、p為模型的參數(shù)，見(jiàn)表1。熱消毒和化學(xué)消毒的曲線決定系數(shù)(R2)分別為0.982 84、0.988 37。R2越接近1，擬合效果越好，圖1模型曲線擬合效果均良好。

表1 兩種消毒模式下細(xì)菌存活率對(duì)數(shù)與觀察時(shí)間關(guān)系擬合方程的相關(guān)參數(shù)

2.2 熱消毒程序過(guò)程中透析用水中內(nèi)毒素含量與溫度變化關(guān)系 采集輸水管路首尾、中間分布的三個(gè)混合室入口部位的透析用水中內(nèi)毒素與溫度的關(guān)系曲線特征變化基本一致。內(nèi)毒素含量隨著溫度不斷上升而增加，隨著冷卻溫度下降而減少。在70、80℃時(shí)整個(gè)管路水中內(nèi)毒素含量最高。首機(jī)處(第一臺(tái)透析機(jī))內(nèi)毒素含量整體水平高于中間機(jī)和尾機(jī)，中間機(jī)和尾機(jī)處的內(nèi)毒素含量高峰對(duì)應(yīng)的溫度略低于首機(jī)處溫度。尾機(jī)處內(nèi)毒素含量在冷卻后30～20℃趨于平穩(wěn)。見(jiàn)圖3。

上述擬合結(jié)果的方程及其參數(shù)，方程為：

(2)

式中x為消毒程序中的溫度變化對(duì)應(yīng)標(biāo)值，A、w、y0、xc為模型的參數(shù)，見(jiàn)表2。首機(jī)、中間機(jī)、尾機(jī)混合室入口處內(nèi)毒素曲線的決定系數(shù)(R2)分別為0.968 59，0.812 31、0.795 24。R2越接近1，擬合效果越好，圖3函數(shù)曲線擬合效果均良好。

表2 熱消毒模式下透析用水內(nèi)毒素含量與溫度變化擬合方程的相關(guān)參數(shù)

2.3 化學(xué)消毒程序過(guò)程中透析用水中內(nèi)毒素含量與時(shí)間變化關(guān)系 采集輸水管路首尾、中間分布的三個(gè)混合室入口部位的透析用水中內(nèi)毒素與時(shí)間的關(guān)系曲線特征變化基本一致。內(nèi)毒素含量集中升高在中間時(shí)段，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)內(nèi)毒素含量下降并趨于平穩(wěn)。在80～120 min消毒程序中的消毒劑浸泡沖洗時(shí)間段，整個(gè)管路水中內(nèi)毒素含量最高，其中首機(jī)處內(nèi)毒素值最高。中間機(jī)內(nèi)毒素含量整體水平高于尾機(jī)，中間機(jī)和尾機(jī)處的內(nèi)毒素含量高峰對(duì)應(yīng)的時(shí)間略早于首機(jī)處。三處內(nèi)毒素含量在沖洗階段后趨于平穩(wěn)。見(jiàn)圖4。

上述擬合結(jié)果的方程及其參數(shù)，方程同2.2中方程(2)，式中x為消毒程序時(shí)間(min),A、w、y0、xc為模型的參數(shù)，見(jiàn)表3。首機(jī)、中間機(jī)、尾機(jī)三條曲線的決定系數(shù)(R2)分別為0.819 30、0.521 38、0.947 61。R2越接近1，擬合效果越好，圖4中間機(jī)的函數(shù)曲線擬合稍差，其余兩條曲線擬合效果良好。

表3 化學(xué)消毒模式下透析用水內(nèi)毒素含量與時(shí)間變化擬合方程的相關(guān)參數(shù)

2.4 兩種消毒程序下20 h內(nèi)透析用水中內(nèi)毒素含量變化 兩種模式下內(nèi)毒素在消毒程序內(nèi)均隨時(shí)間增加而升高，隨后下降到較低的值趨于平穩(wěn)，熱消毒后到15 h時(shí)稍有上升后下降，化學(xué)消毒后水中內(nèi)毒素到12 h時(shí)有逐漸上升趨勢(shì)。見(jiàn)圖5。

上述擬合結(jié)果的方程及其參數(shù)，方程同2.2中方程(2)，式中x為消毒程序時(shí)間(min)、A、w、y0、xc為模型的參數(shù)，見(jiàn)表4。熱消毒和化學(xué)消毒曲線的決定系數(shù)(R2)分別為0.976 97，0.720 97。R2越接近1，擬合效果越好，圖5函數(shù)曲線擬合效果良好。

表4 兩種消毒模式下透析用水內(nèi)毒素含量與時(shí)間變化擬合方程的相關(guān)參數(shù)

3 討 論

臨床上使用的透析用水雖經(jīng)過(guò)反滲處理，但多數(shù)研究證明存在不同程度的污染情況，如細(xì)菌、內(nèi)毒素、細(xì)菌來(lái)源的DNA短片段等大中分子物質(zhì)，并且這些片段及分子物質(zhì)可能通過(guò)透析器膜，從而誘導(dǎo)患者炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，導(dǎo)致慢性炎癥及并發(fā)癥發(fā)生及進(jìn)展[11-12]。透析用水的質(zhì)量保障在于水路系統(tǒng)的消毒維護(hù)。日常按有關(guān)規(guī)范對(duì)透析用水的微生物指標(biāo)定期抽樣監(jiān)測(cè)，對(duì)管路中消毒前后微生物及產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)特征定量觀察也是監(jiān)測(cè)工作中的重要部分。

細(xì)菌含量變化規(guī)律初級(jí)模型擬合顯示，雖熱消毒比化學(xué)消毒的程序時(shí)間長(zhǎng)，但細(xì)菌存活率與消毒程序時(shí)間的關(guān)系呈現(xiàn)相似曲線特征，說(shuō)明兩種消毒處理對(duì)透析用水中細(xì)菌存活影響均較為顯著。兩條曲線50～160 min時(shí)間段細(xì)菌含量變化幅度較大。在不同消毒程序下，化學(xué)消毒比熱消毒使細(xì)菌存活率略低。絕大部分細(xì)菌死亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使消毒完畢無(wú)法達(dá)到100%除菌。

本研究結(jié)果顯示，內(nèi)毒素含量變化對(duì)溫度和過(guò)氧乙酸浸泡敏感，但兩種消毒過(guò)程中內(nèi)毒素變化規(guī)律存在明顯不同。熱消毒機(jī)組有2個(gè)加熱組件，通過(guò)將水溫逐漸加熱并沖洗，后至恒溫85～90℃，管路在程序升溫和冷卻環(huán)節(jié)熱敏顯示溫度是不均衡的，所以使用管路中3個(gè)部位的水樣擬合，綜合說(shuō)明整個(gè)管路真實(shí)情況。高斯函數(shù)擬合結(jié)果顯示，3個(gè)部位的內(nèi)毒素與溫度的關(guān)系曲線特征變化基本一致。內(nèi)毒素含量隨著溫度不斷上升而增加，水溫?zé)釠_擊短時(shí)間可殺死細(xì)菌，同時(shí)釋放大量?jī)?nèi)毒素，在升溫過(guò)程中50、60℃仍有細(xì)菌存活，一些細(xì)菌存活溫度稍高并且細(xì)菌死亡率的倒數(shù)(D值)高，如乳桿菌、假單胞菌等[13]。在70、80℃時(shí)整個(gè)管路水中內(nèi)毒素含量最高。首機(jī)處內(nèi)毒素含量整體水平高于中間機(jī)和尾機(jī)，因?yàn)檫^(guò)渡機(jī)使用頻率低，微生物污染情況相對(duì)較重。中間機(jī)和尾機(jī)處的內(nèi)毒素含量高峰對(duì)應(yīng)的溫度略低于首機(jī)處溫度，是因?yàn)闊崴攘髦潦讬C(jī)，溫度監(jiān)測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)中間和尾機(jī)的溫度上升比首機(jī)慢，同時(shí)也說(shuō)明內(nèi)毒素釋放對(duì)溫度敏感。化學(xué)消毒擬合3個(gè)采樣部位內(nèi)毒素與時(shí)間的變化關(guān)系曲線特征，結(jié)果顯示隨著消毒劑作用時(shí)間內(nèi)毒素先達(dá)到釋放峰值后下降。在80～120 min消毒程序中的過(guò)氧乙酸浸泡沖洗時(shí)間段，整個(gè)管路水中內(nèi)毒素含量最高，其中首機(jī)處內(nèi)毒素值最高釋放晚于中間和尾部管路部位，但在短期集中快速釋放。再次證明過(guò)渡機(jī)的污染情況可能嚴(yán)重。中間機(jī)和尾機(jī)處的內(nèi)毒素含量高峰對(duì)應(yīng)的時(shí)間略早于首機(jī)處，因浸泡完沖洗管內(nèi)水流速約為1 400 L/H，沖流積累可使管路后端內(nèi)毒素含量略高于首機(jī)，并且在沖洗階段后3處內(nèi)毒素含量均趨于平穩(wěn)?；瘜W(xué)消毒程序中浸泡沖洗環(huán)節(jié)對(duì)內(nèi)毒素釋放影響明顯。

觀察剛消毒完后內(nèi)毒素的持續(xù)釋放情況，結(jié)果顯示內(nèi)毒素在兩種消毒程序內(nèi)均隨時(shí)間增加而升高，隨后下降趨于平穩(wěn)，而熱消毒后15 h時(shí)、化學(xué)消毒后12 h水中內(nèi)毒素有逐漸上升趨勢(shì)，出現(xiàn)小峰值。本研究中涉及機(jī)組基本情況為供水管路和消毒機(jī)組管路較新，使用年限僅一年十個(gè)月，輸水管路很長(zhǎng)。消毒機(jī)組管路為316不銹鋼材質(zhì)，供水管路為交聯(lián)聚乙烯(PEX)材質(zhì)。雖標(biāo)準(zhǔn)YY 0572—2015中規(guī)定透析用水中的內(nèi)毒素含量應(yīng)不超過(guò)0.25 EU/mL，干預(yù)水平為0.125 EU/mL。但在臨床實(shí)踐中，因供水分配系統(tǒng)的復(fù)雜性和輸水熱損失、水流波動(dòng)性，會(huì)造成熱消毒、化學(xué)消毒效果的不均衡性[14]。尤其是加熱組件遠(yuǎn)端水路、使用點(diǎn)的熱損失，還有出口、管路拐點(diǎn)消毒浸泡沖洗短暫或易停滯的情況發(fā)生。因管路較新，內(nèi)毒素沒(méi)有超過(guò)限值，但在消毒過(guò)程中個(gè)別點(diǎn)卻達(dá)到干預(yù)值。結(jié)合細(xì)菌存活率試驗(yàn)結(jié)果，可能與細(xì)菌系統(tǒng)再定植有關(guān)。在消毒剛完成的次日，需要關(guān)注患者上機(jī)前制水系統(tǒng)的管理和及時(shí)更換快超期透析機(jī)內(nèi)毒素過(guò)濾器是必要的。

透析用水的供水系統(tǒng)為相對(duì)封閉的環(huán)境，管道系統(tǒng)中的水流，以及系統(tǒng)本身的設(shè)計(jì)和性質(zhì)也可能影響微生物指標(biāo)，如管道系統(tǒng)很可能藏匿著以生物膜方式生活的病原體細(xì)胞等[15-16]。應(yīng)用模型擬合曲線描述透析用水中細(xì)菌失活和內(nèi)毒素釋放變化，模型基于函數(shù)方程，y因變量在研究中為(細(xì)菌存活率對(duì)數(shù)、內(nèi)毒素含量)而隨不同溫度和時(shí)間而變化。除化學(xué)消毒下中間機(jī)的內(nèi)毒素與時(shí)間曲線外，其余曲線估計(jì)的R2值為0.720 97～0.988 37，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)擬合基本良好。說(shuō)明所選函數(shù)模型能夠充分描述透析用水中細(xì)菌和內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)變化特征。消毒全過(guò)程中溫度和時(shí)間是影響透析用水微生物指標(biāo)決定性的參數(shù)。

本研究利用微生物數(shù)據(jù)模型擬合數(shù)據(jù)，用于描述透析用水中細(xì)菌失活和內(nèi)毒素變化規(guī)律，補(bǔ)充細(xì)化透析用水監(jiān)測(cè)方法。但本研究存在一定的局限性，即模型基于一家醫(yī)療機(jī)構(gòu)的數(shù)據(jù)擬合而成，雖然為本省規(guī)模大的血透中心，有一定的參考性，但是缺少多樣本完善數(shù)據(jù)。同時(shí)本研究建立的微生物預(yù)測(cè)模型為初級(jí)，而完善的模型需要長(zhǎng)期、重復(fù)的過(guò)程，并且建立高級(jí)模型，在日后的研究準(zhǔn)備擴(kuò)大樣本、豐富試驗(yàn)設(shè)計(jì)、完善修正數(shù)據(jù)模型。在日常感控工作中，可根據(jù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)血透中心的基本情況，摸底繪制自身消毒過(guò)程下管路水中微生物指標(biāo)變化規(guī)律曲線。在傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)上增加方法，動(dòng)態(tài)分析微生物指標(biāo)的變化有助于更好地達(dá)到透析用水消毒效果，細(xì)化預(yù)防與控制措施。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。