高嫣珺，聶 貞，聶 雅，王 震，卜仕金

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

桿菌肽是一種由芽孢桿菌分泌產(chǎn)生的多肽類抗生素，對(duì)腸道內(nèi)多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抗菌作用，對(duì)部分革蘭氏陰性菌、放線菌、螺旋體亦有抑制作用[1]。桿菌肽特殊的抗菌譜與其無(wú)殘留、不產(chǎn)生耐藥性和無(wú)毒副作用等優(yōu)良特性，使其廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖、獸醫(yī)和人醫(yī)臨床等多個(gè)領(lǐng)域[2]。在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，桿菌肽主要作為飼料添加劑用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高飼料利用率[3-7]，同時(shí)也用于防治壞死性腸炎等腸道疾病、提高氮元素利用率以減少動(dòng)物糞便對(duì)環(huán)境的污染等[8]。2013年，亞甲基水楊酸桿菌肽在我國(guó)獲得農(nóng)業(yè)部藥物添加劑批準(zhǔn)文號(hào)；2019年，亞甲基水楊酸桿菌肽可溶性粉制劑列入第三批獸用處方藥目錄[9]，隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，高效、安全的桿菌肽產(chǎn)品具有越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景。但動(dòng)物性食品生產(chǎn)過(guò)程中仍存在獸藥過(guò)度使用或?yàn)E用現(xiàn)象，獸藥殘留經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體后易導(dǎo)致蓄積毒性、耐藥性等一系列連鎖危害，同時(shí)食品基質(zhì)的復(fù)雜性和獸藥殘留的痕量存在性使得食品中獸藥殘留的準(zhǔn)確定量檢測(cè)存在一定困難[10]。本研究建立的動(dòng)物可食性組織和禽蛋中桿菌肽殘留的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法滿足動(dòng)物可食性組織中桿菌肽殘留限量的檢測(cè)要求，為動(dòng)物性食品中桿菌肽的殘留監(jiān)控提供技術(shù)支撐，對(duì)保障我國(guó)動(dòng)物源性食品安全、促進(jìn)動(dòng)物性食品進(jìn)出口貿(mào)易具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 儀器：AB SCIEX Qtrap 6500plus三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；AB SCIEX ExionLCTMAC高效液相色譜儀；XBridge?BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)；QUINTIX124-1CN電子天平；Eppendorf Centrifuge 5810 R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；Eppendorf可調(diào)微量移液器(10 μL、100 μL、1000 μL、5000 μL)；Nylon 0.22 μm有機(jī)相針式濾器；Agilent Bond Elut Plexa PCX(3 mL, 60 mg)固相萃取柱；WATERS OASIS?MCX(3 mL, 60 mg)固相萃取柱。

試劑：桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品(桿菌肽A、B1、B2和B3總含量84.8%，桿菌肽A含量53.2%。規(guī)格：100 mg；批號(hào)：C10418000；購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)；甲酸、濃氨水(色譜純，上海阿拉丁公司)；乙酸乙酯、正己烷(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；三氯乙酸(分析純，上海MACKLIN公司)；水為符合GB/T 6682標(biāo)準(zhǔn)的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配置 準(zhǔn)確稱取約7.37 mg桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品粉末于25 mL的容量瓶中，加入適量的0.1%甲酸甲醇溶解并定容至刻度，即配置濃度為0.25 mg/mL(以桿菌肽計(jì))的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃冰箱中保存。準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.1%甲酸甲醇稀釋制備濃度為1000、10000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 動(dòng)物可食性組織包括豬、雞和鴨的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織，空白動(dòng)物可食性組織以潔凈手術(shù)剪適當(dāng)剪碎，用勻漿機(jī)攪碎；禽蛋包括雞蛋和鴨蛋，去除蛋殼，取全部蛋清和蛋黃，用勻漿機(jī)攪勻。稱取(2.0 ±0.01)g勻漿后空白動(dòng)物可食性組織和禽蛋樣品于50 mL離心管A中，加入4.0 mL 4%三氯乙酸乙腈溶液，渦旋2 min，加入4.0 mL 0.1%甲酸水溶液渦旋提取5 min，隨后12000 r/min離心6 min(4 ℃)，轉(zhuǎn)移上清液至于50 mL離心管B中。殘?jiān)辞笆霾襟E重復(fù)提取一次，合并上清于離心管B中備用。離心管B中加入經(jīng)0.1%甲酸水溶液飽和的正己烷3.0 mL，渦旋混合1 min，隨后8000 r/min離心5 min，棄去上層有機(jī)相及中間乳化層，保留下層溶液待凈化。

動(dòng)物可食性組織使用Agilent Bond Elut Plexa PCX(3 mL, 60 mg)固相萃取柱凈化，禽蛋使用OASIS?MCX(3 mL, 60 mg)固相萃取柱凈化。依次用3.0 mL甲醇和3.0 mL 0.1%甲酸水溶液活化固相萃取柱，取前述步驟處理得到的樣品液過(guò)柱，隨后依次用3.0 mL 1%甲酸乙酸乙酯和3.0 mL甲醇淋洗，淋洗完畢后抽干萃取柱，用3.0 mL 0.5%氨水甲醇溶液洗脫，收集全部洗脫液于10 mL具塞離心管中，離心管中加入1.0 mL 0.1%甲酸水溶液，渦旋混勻后經(jīng)孔徑0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液收集至1.5 mL進(jìn)樣瓶中，待檢測(cè)。

1.3.2 液相色譜條件優(yōu)化 XBridge?BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈；液相色譜梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化 電噴霧離子源(Turbo ion Spray)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；氣簾氣壓力：40.0 psi；碰撞氣壓力：Medium；電離電壓：5500 V；離子源溫度：550 ℃。根據(jù)桿菌肽離子掃描結(jié)果，相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 桿菌肽質(zhì)譜參數(shù)

1.4 定性方法 通過(guò)待測(cè)物色譜圖的保留時(shí)間與對(duì)照品保留時(shí)間、待測(cè)物色譜峰特征離子與相應(yīng)濃度對(duì)照品色譜峰的特征離子相對(duì)照進(jìn)行定性。

定性測(cè)試需要滿足以下條件：①與受試藥物相同的離子峰在空白樣品圖譜中不出現(xiàn)；②定性離子色譜峰的信噪比≥3；③待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)液中目標(biāo)峰的保留時(shí)間偏差不超出±2.5%；④樣品中特征離子對(duì)的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液的相對(duì)豐度一致，偏差滿足2002/657/EC[11]中的要求。

1.5 定量方法

1.5.1 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別稱取各動(dòng)物的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織及禽蛋的空白樣品，經(jīng)前處理后得到空白基質(zhì)液并加入適量的標(biāo)準(zhǔn)工作液配制濃度為50、100、250、500、750、1000 ng/g的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，在本試驗(yàn)建立的色譜和質(zhì)譜條件下，按照濃度從低到高的順序依次進(jìn)樣檢測(cè)。以測(cè)得的桿菌肽特征離子峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 檢測(cè)限和定量限的確定 分別稱取各動(dòng)物的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織及禽蛋的空白樣品，經(jīng)前處理得到空白基質(zhì)液并加入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液制備不同濃度的空白基質(zhì)添加樣品，每個(gè)濃度5個(gè)平行，在本試驗(yàn)建立的色譜和質(zhì)譜條件下依次進(jìn)樣檢測(cè)，取信噪比(S/N)≥3時(shí)的桿菌肽添加濃度為方法的檢測(cè)限(LOD)，信噪比(S/N)≥10時(shí)的桿菌肽添加濃度為方法的定量限(LOQ)。

1.5.3 準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定 本方法以組織添加樣品的回收率考察準(zhǔn)確度，回收率的批內(nèi)變異系數(shù)考察精密度，批間變異系數(shù)考察重復(fù)性，選定添加濃度50、100、500和750 ng/g作為添加回收試驗(yàn)的四個(gè)濃度。分別準(zhǔn)確稱取(2.0±0.01)g各動(dòng)物的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織及禽蛋的空白樣品，加入適量的標(biāo)準(zhǔn)工作液。按1.3項(xiàng)下的條件處理、分析。測(cè)定結(jié)果代入各組織的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品實(shí)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)濃度峰面積比值，記為本方法的回收率。每批次每個(gè)濃度制備5個(gè)平行樣品，共測(cè)定三個(gè)分析批次分三天完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜行為 在本試驗(yàn)的優(yōu)化的質(zhì)譜和色譜條件下，桿菌肽出峰時(shí)間約為3.19 min，目標(biāo)峰與基質(zhì)雜質(zhì)峰分離良好，桿菌肽目標(biāo)峰峰型尖銳，可用于定量分析(圖1)。

圖1 桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品總離子流色譜圖(桿菌肽50 ng/g)

對(duì)比各動(dòng)物可食性組織(肌肉、肝臟、腎臟、脂肪)及禽蛋(雞蛋、鴨蛋)空白基質(zhì)圖譜與空白基質(zhì)添加桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，顯示桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品與空白基質(zhì)雜質(zhì)分離良好且互不干擾，可用于定量分析。掃描空白基質(zhì)與空白基質(zhì)添加藥物(50 ng/g)樣品中桿菌肽定量離子對(duì)(712.2>199.0)的離子流圖見(jiàn)圖2～圖9。

圖2 添加桿菌肽的豬可食性組織總離子流色譜圖

圖3 空白豬可食性組織總離子流色譜圖

圖4 添加桿菌肽的雞可食性組織總離子流色譜圖

圖5 空白雞可食性組織總離子流色譜圖

圖6 添加桿菌肽的鴨可食性組織總離子流色譜圖

圖7 空白鴨可食性組織總離子流色譜圖

圖8 添加桿菌肽的禽蛋組織總離子流色譜圖

圖9 空白禽蛋組織總離子流色譜圖

2.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線 桿菌肽在空白基質(zhì)中添加50～1000 ng/g范圍內(nèi)，添加濃度和目標(biāo)峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r>0.999(表3)。

表3 各動(dòng)物組織和禽蛋中的桿菌肽含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.3 檢測(cè)限和定量限 取S/N≥3時(shí)濃度為檢測(cè)限，本方法檢測(cè)限為30 ng/g；根據(jù)精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果，取S/N≥10時(shí)濃度為定量限，本方法定量限為50 ng/g。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度 制備各動(dòng)物組織和禽蛋在50、100、500、750 ng/g四個(gè)添加濃度下的組織添加樣品，進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，批內(nèi)、批間平均回收率及變異系數(shù)結(jié)果見(jiàn)表4、表5，桿菌肽在各組織中的平均回收率為66.2%～84.7%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%。

表4 豬可食性組織中桿菌肽添加回收率及變異系數(shù)(n=5)

表5 雞、鴨可食性組織及禽蛋中桿菌肽添加回收率及變異系數(shù)(n=5)

2.5 定性試驗(yàn) 定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)中各動(dòng)物可食性組織和禽蛋中內(nèi)源性雜質(zhì)不影響目標(biāo)物質(zhì)的定量。在本試驗(yàn)建立的色譜條件下，目標(biāo)峰分離良好且峰型尖銳，利于定量分析，基質(zhì)添加樣品中桿菌肽相對(duì)離子豐度符合定性測(cè)試要求。

3 討 論

3.1 前處理方法的優(yōu)化 試驗(yàn)比較了多種沉淀蛋白的方法，結(jié)果顯示，使用甲醇沉淀蛋白后提取液澄清，但易堵塞萃取柱；使用乙腈沉淀蛋白，個(gè)別組織提取液不澄清，難以除去懸浮殘?jiān)?；使?%～10%不同濃度的三氯乙酸乙腈溶液，在4%和10%濃度下，動(dòng)物組織樣品和禽蛋樣品可以獲得澄清的提取液，且不會(huì)堵塞萃取柱。故本試驗(yàn)選定4%和10%三氯乙酸乙腈作為蛋白沉淀劑。同時(shí)比較了先提取后沉淀蛋白和先沉淀蛋白后提取兩種不同順序，結(jié)果顯示，先提取后沉淀蛋白，色譜圖中會(huì)出較大干擾峰，干擾定量測(cè)定。沉淀蛋白后的提取液使用0.5%三氟乙酸水溶液進(jìn)一步提取樣品，并且兩次重復(fù)提取以確保樣品中的桿菌肽提取完全。

試驗(yàn)比較了多種固相萃取柱的凈化效果，參考全家興[12]的報(bào)道選用HLB萃取柱凈化樣品，并使用含TFA的提取液以增加目標(biāo)物保留度，結(jié)果顯示HLB萃取柱對(duì)樣品凈化能力較強(qiáng)，但加樣回收率不穩(wěn)定。已知桿菌肽在酸性溶液中溶解度更好，故嘗試用于堿性物質(zhì)分析的混合型陽(yáng)離子交換柱，洗脫液為5%氨水∶甲醇(V/V∶10/90)的偏堿性溶液。分別以甲醇/乙腈作為蛋白沉淀劑，0.1%甲酸水/0.5%三氟乙酸水為提取液，對(duì)HLB和MCX的柱保留效果進(jìn)行比較，對(duì)比結(jié)果中除HLB萃取柱在用乙腈沉蛋白時(shí)柱回收率較低外，其他結(jié)果基本處在同一水平，并且MCX萃取柱在以上幾種條件下結(jié)果均保持穩(wěn)定。PCX與MCX屬于同類型的陽(yáng)離子交換柱，但PCX過(guò)柱流速更快，且柱回收良好，可縮短樣品處理時(shí)間。使用酸性水溶液取代純水對(duì)陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行活化，可以提高對(duì)目標(biāo)物的保留度，MCX萃取柱由70.27%提升為85.86%，PCX萃取柱由84.2%提升為104.31%。但禽蛋樣品使用PCX萃取柱回收率較低，嘗試更換不同萃取柱進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示MCX萃取柱可得到更好的結(jié)果。由于上述結(jié)果中使用含離子對(duì)試劑(TFA)提取液與甲酸水溶液提取的結(jié)果差異不顯著，故選用0.1%甲酸水作為提取液，以簡(jiǎn)化試驗(yàn)中使用的試劑。使用經(jīng)提取液飽和的正己烷除脂，防止樣品提取液與正己烷互溶。參照萃取柱說(shuō)明書上的凈化程序，選用中性淋洗液(甲醇)和酸性淋洗液(1%甲酸乙酸乙酯)除去雜質(zhì)。

3.2 液相色譜條件的優(yōu)化 本試驗(yàn)選用XBridge?BEH C18130A色譜柱，亞乙基橋雜化(BEH)顆粒技術(shù)對(duì)堿性化合物有很好的保留，且pH耐受范圍大，是肽類化合物專用色譜柱。流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水體系，該體系下桿菌肽峰型良好，利于定量分析。為進(jìn)一步提高檢測(cè)效率，適當(dāng)縮短梯度洗脫時(shí)間，縮短后的洗脫程序?yàn)橐译妫?～0.5 min 15%，5.0～5.5 min 85%，5.6～6.5 min 15%，桿菌肽出峰時(shí)間約為3.19 min，峰型良好，與大部分雜質(zhì)可以分離，可用于定量分析。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 桿菌肽在質(zhì)譜掃描中一般為加氫離子，并且可觀察到三種電荷態(tài)，其中荷2個(gè)質(zhì)子的桿菌肽豐度最高[13]，結(jié)合實(shí)際離子掃描結(jié)果選取了[M+2H]2+作為質(zhì)譜掃描中的母離子。最初選取712.2(桿菌肽A)和704.8(桿菌肽B)作為母離子進(jìn)行離子掃描，進(jìn)一步轟擊母離子產(chǎn)生子離子后，選取712.2>199.0、712.2>226.9和704.8>199.0、704.8>227.0分別作為定量、定性監(jiān)測(cè)離子對(duì)。確定檢測(cè)離子對(duì)后需要先后優(yōu)化其碰撞能(CE)和去簇電壓(DP)。碰撞能使母離子裂解產(chǎn)生子離子，去簇電壓可防止擊碎的子離子再次聚合。優(yōu)化結(jié)果分別為56、48、54、47、130、140 V(同一母離子的子離子有相同的DP值)。在后續(xù)HPLC-MS/MS檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)桿菌肽B的檢測(cè)離子對(duì)704.8>199.0、704.8>227.0，因同分異構(gòu)體的存在，在色譜行為中分裂為三個(gè)峰，分裂后的峰響應(yīng)值較低，不利于定量分析。且按照藥品說(shuō)明書的標(biāo)識(shí)桿菌肽B總含量應(yīng)為31.6%，但三個(gè)同分異構(gòu)體的含量并不明確，考慮到這種不確定性，選取含量明確且穩(wěn)定的桿菌肽A的離子對(duì)：712.0>199.0、712.0>227.0，作為本試驗(yàn)中的定量、定性離子對(duì)進(jìn)行檢測(cè)。

4 結(jié) 論

本研究摸索和優(yōu)化了樣品前處理方法及儀器條件，建立了豬、雞、鴨的可食性組織及禽蛋中桿菌肽殘留的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法，樣品經(jīng)0.1%甲酸水提取，三氯乙酸乙腈沉淀蛋白，正己烷除脂，固相萃取柱凈化后，進(jìn)HPLC-MS/MS檢測(cè)。以0.1%甲酸水和乙腈作為流動(dòng)相梯度洗脫，質(zhì)譜采用電噴霧離子源，正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在50～1000 ng/g添加濃度范圍內(nèi)，濃度與目標(biāo)峰面積線性關(guān)系良好，r>0.999，LOD≥30 ng/g，LOQ≥50 ng/g。平均回收率66.2%～84.7%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%。本試驗(yàn)建立的動(dòng)物可食性組織和禽蛋中桿菌肽殘留的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法符合生物樣品定量分析驗(yàn)證指導(dǎo)原則的規(guī)定，滿足動(dòng)物可食性組織中桿菌肽殘留限量的檢測(cè)要求。