張欣，武斌，陳西華，王樹(shù)芳，魯聰，劉婷婷，楊旭清，賀斌，徐祥波*

(1.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3. 山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院，濟(jì)南 250013；4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003；5. 遵義醫(yī)科大學(xué)，遵義 563006)

月經(jīng)是女性體內(nèi)重要的生理現(xiàn)象，自青春期開(kāi)始至絕經(jīng)結(jié)束，在雌激素和孕激素的嚴(yán)密調(diào)控下，子宮內(nèi)膜可發(fā)生周期性變化即月經(jīng)周期，月經(jīng)周期通常分為增生期、分泌期、月經(jīng)期。月經(jīng)周期過(guò)程中子宮內(nèi)膜、血管腺體發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，子宮內(nèi)膜經(jīng)歷大規(guī)模崩解出血和重塑，但對(duì)于月經(jīng)發(fā)生機(jī)制的研究目前仍不明確。經(jīng)典的月經(jīng)發(fā)生假說(shuō)為Markee[1]利用恒河猴對(duì)月經(jīng)發(fā)生開(kāi)展的研究。在恒河猴的眼前房中植入人子宮內(nèi)膜外植體，研究發(fā)現(xiàn)在月經(jīng)產(chǎn)生前，螺旋動(dòng)脈血管節(jié)律性舒張和收縮，螺旋動(dòng)脈持續(xù)收縮約24 h后，子宮內(nèi)膜組織發(fā)生崩解并出血。因此推測(cè)，月經(jīng)可能是由于子宮內(nèi)膜螺旋動(dòng)脈持續(xù)收縮導(dǎo)致低氧，組織血供減少，缺血壞死從而崩解出血。

不同研究組關(guān)于低氧是否直接導(dǎo)致子宮內(nèi)膜崩解等關(guān)鍵問(wèn)題眾說(shuō)紛紜。子宮內(nèi)膜的低氧狀態(tài)可以通過(guò)子宮內(nèi)膜血流減少、血氧分壓降低和檢測(cè)低氧標(biāo)志物(派諾硝唑)判定。根據(jù)一項(xiàng)利用核素133氙(133Xe)清除技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜血流在臨月經(jīng)期前或月經(jīng)期間并未減少[2]。Gannon等[3]使用激光多普勒技術(shù)也未在人類月經(jīng)周期各個(gè)時(shí)間發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜組織低氧缺血或月經(jīng)期出血的證據(jù)。Zhang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下，與子宮內(nèi)膜崩解密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶proMMP-1、proMMP-3和MT1-MMP的生成以及MMP-2的活化受抑制，低氧誘導(dǎo)因子(HIF)1A僅在少數(shù)人子宮內(nèi)膜圍月經(jīng)期標(biāo)本的基質(zhì)細(xì)胞中存在。Coudyzer等[5]研究發(fā)現(xiàn)人子宮內(nèi)膜異體移植物在激素撤退處理時(shí)會(huì)發(fā)生蛻膜化并崩解，但并未發(fā)現(xiàn)氧分壓顯著變化，只在部分移植物中發(fā)現(xiàn)低氧標(biāo)志物派諾硝唑的表達(dá)。以上研究顯示低氧狀態(tài)并未在子宮內(nèi)膜組織大范圍存在，在子宮內(nèi)膜崩解前并未出現(xiàn)低氧。然而，也有多項(xiàng)研究支持月經(jīng)期間存在低氧現(xiàn)象。Fan等[6]發(fā)現(xiàn)在小鼠月經(jīng)模型中，孕酮撤退后2 d，在組織邊緣發(fā)現(xiàn)低氧標(biāo)志物陽(yáng)性顯色。有研究發(fā)現(xiàn)孕酮撤退后8 h和24 h在子宮內(nèi)膜的分離區(qū)和蛻膜化細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)存在[7-8]。本研究室前期研究利用小鼠月經(jīng)模型發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜崩解期間HIF1A存在[9]且表達(dá)增加[10]。上述研究提示低氧與子宮內(nèi)膜崩解相關(guān)，但是否存在始動(dòng)關(guān)系并不明確。

本研究以體外人蛻膜基質(zhì)細(xì)胞模型為基礎(chǔ)，分別進(jìn)行孕酮撤退/維持與不同氧濃度培養(yǎng)聯(lián)合處理，探索HIF1A的表達(dá)與激活狀態(tài)，以及不同孕酮濃度與氧分壓條件下崩解相關(guān)基因MMPs的表達(dá)變化，以期探究低氧和HIF1A與子宮內(nèi)膜崩解的始動(dòng)關(guān)系。

材料與方法

一、研究對(duì)象

人子宮內(nèi)膜組織樣本取自月經(jīng)周期10～15 d、因醫(yī)學(xué)指征行子宮切除術(shù)的正常月經(jīng)周期婦女(38～45歲，6例)，所有對(duì)象在過(guò)去3個(gè)月未接受任何激素治療。樣本在組織學(xué)上被指定為增生晚期或分泌早期。根據(jù)之前文獻(xiàn)方法[11-12]分離和培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(hESCs)。

二、主要試劑與儀器

孕酮(Sigma-Aldrich，美國(guó))，密封細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))，兔抗催乳素(PRL)多克隆抗體(1∶250，A0569，Dako，丹麥)，蘇木素伊紅染液(珠海貝索)、山羊抗兔增強(qiáng)二步法檢測(cè)試劑盒(PV-6001，北京中杉金橋)和DAB顯色試劑盒(ZLI-9018，北京中杉金橋)，核蛋白提取試劑盒(NE-PER，Thermo Fisher Scientific，美國(guó))，兔抗HIF1A單克隆抗體(1∶500，NB100-134，Novus，美國(guó))，兔抗β-Actin單克隆抗體(1∶2 000，北京科溫)，小鼠抗LAMIN-B1單克隆抗體(1∶200，SC-20682，Santa Cruz，美國(guó))，兔抗PRL單克隆抗體(1∶200，MA1-610，Invitrogen，美國(guó))，山羊抗兔二抗(proteintech，美國(guó))，山羊抗小鼠二抗(proteintech，美國(guó))，PRL檢測(cè)試劑盒(SCA846Hu，武漢克隆科技)，StepOneTM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(ABI，美國(guó))，Trizol(Invitrogen，美國(guó))，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Takara Bio，日本)，Bis-Tris凝膠(Nu-PAGE Novex，Invitrogen，美國(guó))，聚偏二氟乙烯膜(PVDF，Millipore，英國(guó))，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記小鼠抗兔IgG(1∶10 000，Sigma，英國(guó))，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)(P2300，蘇州新賽美)，化學(xué)發(fā)光儀(K3Plus，上海寶予德)。

三、研究方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：將人子宮內(nèi)膜蛻膜基質(zhì)細(xì)胞按孕酮撤退(PW+)、孕酮維持(PW-)、正常氧培養(yǎng)(低氧-)、低氧培養(yǎng)(低氧+)聯(lián)合處理，共分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組：PW-低氧-組，PW-低氧+組，PW+低氧-組，PW+低氧+組。孕酮撤退即使用無(wú)激素培養(yǎng)基替換原含激素的蛻膜化誘導(dǎo)培養(yǎng)基；孕酮維持即繼續(xù)使用含激素的蛻膜化誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。正常氧培養(yǎng)為21%O2的常規(guī)體外細(xì)胞培養(yǎng)條件；低氧培養(yǎng)為2%O2的低氧培養(yǎng)條件。除此之外，其他均按常規(guī)的體外細(xì)胞培養(yǎng)條件，即37℃、5%CO2和93%N2。

2.hESCs分離：將術(shù)中取下的人子宮內(nèi)膜組織，在無(wú)菌條件下使用Hank’s緩沖液沖洗子宮內(nèi)膜，洗凈血凝塊。將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊，濾凈緩沖液，加入3～5倍體積的0.25%膠原酶Ⅳ(Sigma，美國(guó))混勻，置于37℃培養(yǎng)箱中60 min，每隔15 min混勻，使細(xì)胞充分分離。加入DNA酶(Merkur，美國(guó))，并用200目(孔徑68 μm)、400目(孔徑37 μm)和500目(孔徑30 μm)的無(wú)菌不銹鋼篩網(wǎng)依次過(guò)濾，收集過(guò)濾液，1 500 r/m離心5 min，棄去上清，沉淀主要為hESCs。

3.細(xì)胞培養(yǎng)與純化：往沉淀中加入含10%活性炭吸附胎牛血清(charcoal stripped FBS，Gibco，Thermo Scientific，美國(guó))、100 U/ml青霉素(Merkur，美國(guó))和100 mg/ml鏈霉素(Merkur，美國(guó))的無(wú)酚紅DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，Thermo Scientific，美國(guó))重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，以5×106細(xì)胞量接種于25 cm2培養(yǎng)瓶(Corning，美國(guó))，培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞與上皮細(xì)胞貼壁時(shí)間的差異進(jìn)行基質(zhì)細(xì)胞純化。細(xì)胞接種90～120 min后，更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

4.hESCs體外誘導(dǎo)蛻膜化：蛻膜化組處理方式為用含2%活性炭吸附胎牛血清(Gibco，Thermo Scientific，美國(guó))、100 nmol/L甲羥孕酮(MPA)(Merkur，美國(guó))、10 nmol/L雌二醇(E2)(Sigma，美國(guó))、加入抗生素的無(wú)酚紅DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，Thermo Scientific，美國(guó))聯(lián)合培養(yǎng)hESCs 11 d，每48 h更換1次培養(yǎng)基。使用無(wú)激素基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)hESCs作為誘導(dǎo)對(duì)照組，培養(yǎng)11 d，每48 h更換1次培養(yǎng)基。

5.hESCs蛻膜化驗(yàn)證：采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)法。用無(wú)菌多聚賴氨酸預(yù)處理玻璃片5 min，風(fēng)干后，放入24孔或6孔板中，鋪平。將細(xì)胞懸液滴入24孔板或6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到一定時(shí)間，取出爬片。用PBS緩沖液清洗爬片10 s/次，使用4%甲醛固定15 min；PBS清洗5 min/次，洗2次，使用封閉液封閉10 min；加入兔抗PRL單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜，PBS清洗5 min/次，洗2次；加入山羊抗兔增強(qiáng)二步法檢測(cè)試劑盒(PV-6001，北京中杉金橋)，37℃孵育1 h，PBS清洗5 min/次，洗2次；進(jìn)行DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片，在顯微鏡下進(jìn)行閱片。

6. 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PRL的檢測(cè)：使用化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(CLIA)試劑盒(SCA846Hu，武漢克隆科技)。吸取蛻膜化組與誘導(dǎo)對(duì)照組的0、2、4、6、8和9 d細(xì)胞培養(yǎng)上清液，低溫離心機(jī)12 000 r/m 離心5 min，吸取上清待測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣本在相同條件下，37℃孵育1 h；吸棄板中液體，加入檢測(cè)溶液A 100 μl，37℃孵育1 h；洗板3次；加檢測(cè)液B 100 μl，37℃孵育30 min；洗板5次；加底物100 μl，37℃孵育10 min；將測(cè)試板加入化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行讀數(shù)。

7. 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：利用Trizol從培養(yǎng)的hESCs中提取總RNA。用大約2 μg總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑在StepOneTM實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國(guó))上進(jìn)行PCR檢測(cè)，各基因使用特定的引物(引物序列詳見(jiàn)表1)。使用β-Actin作為內(nèi)部對(duì)照。熱循環(huán)條件如下：?jiǎn)?dòng)激活周期95℃ 5 min，之后40個(gè)變性周期(95℃ 10 s)，退火，擴(kuò)增(60℃ 34 s)。測(cè)定人MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9和MMP-13的相對(duì)mRNA表達(dá)水平。所有反應(yīng)重復(fù)3遍。使用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量計(jì)算，其中ΔΔCt為校準(zhǔn)Ct值。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR分析的引物序列

8.免疫印跡分析(Western blot)：通過(guò)免疫印跡法分析檢測(cè)HIF1A蛋白。使用核質(zhì)提取試劑盒(Thermo Scientific，美國(guó))提取胞核和胞漿蛋白。之后，以2∶1的比例將15 μg胞漿或胞核蛋白懸于Laemmli緩沖液(125 mmol/L Tris-HCl，4%十二烷基硫酸鈉、5% 2-巰基乙醇、20%甘油和0.05%溴酚藍(lán))(上海碧云天)，在95℃變性5 min。使用4%～12% Bis-Tris凝膠分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含有吐溫-20的5%脫脂奶粉Tris緩沖鹽水(北京索萊寶)在室溫下封閉膜1 h。將PVDF膜與抗HIF1A抗體4℃孵育過(guò)夜。對(duì)于胞漿蛋白，使用抗β-Actin抗體作為內(nèi)參；對(duì)于胞核蛋白，使用抗-LAMIN-B1抗體作為內(nèi)參。洗滌后，將膜與HRP標(biāo)記的小鼠抗兔IgG室溫孵育2 h。之后在PVDF膜上滴加ECL，使用發(fā)光儀進(jìn)行蛋白顯影。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、hESCs體外誘導(dǎo)蛻膜化

1.形態(tài)學(xué)觀察：將純化的hESCs接種到6孔板后，待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%(約3 d)，然后進(jìn)行誘導(dǎo)蛻膜化處理。誘導(dǎo)前，hESCs呈梭形，散落鋪在6孔板上(圖1A)。將hESCs誘導(dǎo)蛻膜化后，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變大變圓，細(xì)胞界限逐漸模糊(圖1B)，同時(shí)與誘導(dǎo)對(duì)照組的hESCs進(jìn)行對(duì)比，誘導(dǎo)對(duì)照組細(xì)胞仍呈現(xiàn)梭形(圖1C)，細(xì)胞形態(tài)與誘導(dǎo)前細(xì)胞(圖1A)幾乎沒(méi)有發(fā)生變化。

2.免疫組化法檢測(cè)PRL蛋白的表達(dá)：結(jié)果顯示，蛻膜化誘導(dǎo)后在細(xì)胞的胞漿中檢測(cè)到PRL陽(yáng)性信號(hào)(圖1D)。

3.蛻膜化細(xì)胞上清液中PRL的濃度：誘導(dǎo)對(duì)照組PRL表達(dá)量一直維持在極低水平。蛻膜化誘導(dǎo)后，細(xì)胞上清液中PRL濃度隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，在蛻膜化誘導(dǎo)第8天達(dá)到峰值，第9天的表達(dá)量有所下降(圖1E)。

A：hESCs蛻膜化誘導(dǎo)前；B：hESCs蛻膜化誘導(dǎo)后；C：hESCs誘導(dǎo)對(duì)照組；D：hESCs蛻膜化誘導(dǎo)后PRL蛋白表達(dá)；E：hESCs上清中PRL含量檢測(cè)：與誘導(dǎo)對(duì)照組比較，**P<0.01。圖1 誘導(dǎo)hESCs蛻膜化

二、各組細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中HIF1A蛋白表達(dá)水平比較

結(jié)果顯示，PW-低氧+組細(xì)胞質(zhì)中HIF1A表達(dá)水平顯著低于PW-低氧-組(P<0.05)，而細(xì)胞核中的HIF1A表達(dá)水平顯著高于PW-低氧-組(P<0.05)；PW+低氧+組細(xì)胞質(zhì)中HIF1A表達(dá)水平與PW+低氧-組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；PW+低氧+組細(xì)胞核中HIF1A表達(dá)水平顯著高于其他3組(P<0.05)(圖2)。結(jié)果提示孕酮撤退與低氧能促進(jìn)HIF1A激活。

三、各組細(xì)胞中MMPs mRNA表達(dá)水平比較

結(jié)果顯示，PW-低氧+組與PW-低氧-組MMPsmRNA表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)；但與PW-低氧-組比較，PW+低氧-組MMP-1、MMP-3及MMP-7 mRNA表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；與PW-低氧+組比較，PW+低氧+組MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)水平顯著增高(P<0.01)(圖3)。

A：Western blot檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中HIF1A表達(dá)；B：Western blot檢測(cè)細(xì)胞核中HIF1A表達(dá)；C：細(xì)胞質(zhì)中HIF1A相對(duì)表達(dá)水平；D：細(xì)胞核中HIF1A相對(duì)表達(dá)水平。與PW-低氧-組比較，*P<0.05；與其他3組比較，#P<0.05。圖2 各組人蛻膜化基質(zhì)細(xì)胞中HIF1A表達(dá)

注：與PW-低氧-組比較，*P<0.05，**P<0.01；與PW-低氧+組比較，#P<0.01。圖3 各組細(xì)胞中MMPs mRNA表達(dá)水平比較

討 論

女性月經(jīng)是重要的生理現(xiàn)象，其在雌、孕激素的嚴(yán)密調(diào)控下經(jīng)歷周期性變化。月經(jīng)周期異常容易導(dǎo)致月經(jīng)出血過(guò)多、月經(jīng)不調(diào)、腹痛、閉經(jīng)、絕經(jīng)等，影響女性生殖健康和生活質(zhì)量，甚至引發(fā)家庭經(jīng)濟(jì)問(wèn)題[13]。月經(jīng)發(fā)生相關(guān)的研究及其對(duì)女性生殖健康的影響仍然值得關(guān)注。

月經(jīng)的發(fā)生需要必要的激素、hESCs蛻膜化和孕酮撤退這3個(gè)條件[14-15]。hESCs蛻膜化時(shí)基質(zhì)細(xì)胞生化和形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，這是發(fā)生在月經(jīng)周期中后期的重要生理事件。在這一過(guò)程中蛻膜基質(zhì)細(xì)胞變圓變大，這種形態(tài)學(xué)的改變導(dǎo)致PRL等標(biāo)記基因的表達(dá)增加[16]。本研究通過(guò)觀察hESCs的形態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞中PRL含量變化，驗(yàn)證hESCs體外誘導(dǎo)蛻膜化造模成功。

不同的研究組通過(guò)動(dòng)物模型或人子宮內(nèi)膜細(xì)胞對(duì)低氧與月經(jīng)發(fā)生之間關(guān)系的研究結(jié)果各不相同。Reavey等[17]提出了一種非侵入性檢測(cè)子宮內(nèi)膜低氧的技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)人月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜中低氧標(biāo)志物表達(dá)顯著升高。同時(shí)本研究室前期研究中利用小鼠月經(jīng)樣模型發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜崩解期間HIF的表達(dá)增加[10]。本研究結(jié)果顯示，PW-低氧+組與PW-低氧-組相比，細(xì)胞質(zhì)的HIF1A表達(dá)明顯降低，但胞核中的表達(dá)顯著增高(P<0.05)。此外，PW+低氧+組和PW+低氧-組間，細(xì)胞質(zhì)HIF1A表達(dá)水平無(wú)顯著變化，但PW+低氧+組細(xì)胞核的HIF1A表達(dá)顯著增高(P<0.05)，提示孕酮撤退與低氧有利于細(xì)胞核中HIF1A的激活。有研究稱，月經(jīng)是孕酮撤退引發(fā)的生理事件[18]，這也提示子宮內(nèi)膜細(xì)胞崩解后低氧狀態(tài)的存在。

hESCs發(fā)生蛻膜化時(shí)MMPs降解基質(zhì)組織的行為增強(qiáng)[19]。MMPs是月經(jīng)期間發(fā)揮重要作用的裂解酶，有文獻(xiàn)報(bào)道MMPs在恒河猴子宮崩解期間發(fā)揮重要作用[20]。孕酮撤退使得MMP-1，-2，-3在月經(jīng)周期表達(dá)下降，并抑制月經(jīng)[21]。在Zhang等[4]的研究中，人子宮內(nèi)膜細(xì)胞在低氧條件下通過(guò)激素撤退培養(yǎng)，這些低氧培養(yǎng)細(xì)胞之后進(jìn)行正常氧恢復(fù)培養(yǎng)，結(jié)果顯示低氧組MMP-2、pro MMP-1和pro MMP-3的產(chǎn)生被抑制。還有研究報(bào)道在低氧條件下培養(yǎng)24 h后，可以在整個(gè)子宮內(nèi)膜外植體的培養(yǎng)物上清液中觀察到MMPs的表達(dá)減少[22]。本研究檢測(cè)崩解相關(guān)因子MMPs的表達(dá)，結(jié)果顯示PW-低氧+和PW-低氧-組的MMPsmRNA表達(dá)無(wú)顯著差異。但是，PW+低氧-組與PW-低氧-組相比，孕酮撤退使MMP-1、MMP-3及MMP-7 mRNA的表達(dá)顯著增高(P<0.05)；在PW+低氧+組，MMP-1表達(dá)水平比PW-低氧+組增高約5倍(P<0.01)，MMP-3表達(dá)增高約3倍(P<0.01)。提示孕酮撤退顯著提高了MMP-1、MMP-3和MMP-7的表達(dá)水平(P<0.01)，這與先前在獼猴[21]、小鼠[23]和人類[24]研究子宮內(nèi)膜崩解過(guò)程中關(guān)于MMP-1、MMP-3和MMP-7的研究結(jié)果一致。提示低氧參與了在子宮內(nèi)膜崩解激活后MMPs的調(diào)節(jié)。孕酮撤退后低氧條件下顯著增強(qiáng)了MMP-1和MMP-3的mRNA表達(dá)，表明MMP-1和MMP-3的表達(dá)是由孕酮撤退觸發(fā)的，并且因低氧狀態(tài)增強(qiáng)表達(dá)，低氧在子宮內(nèi)膜崩解被激活后參與MMPs調(diào)節(jié)。這些體內(nèi)和體外證據(jù)顯示，低氧參與了子宮內(nèi)膜崩解，但尚未確定孕酮撤退對(duì)低氧的功能調(diào)節(jié)。