朱文倩，張慧敏，李磊，趙明子，郝翠芳*

(1.濱州醫(yī)學(xué)院，煙臺(tái) 264003；2.青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院，青島 266000；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，青島 266000)

卵巢儲(chǔ)備功能與女性的生殖潛能密切相關(guān)，其主要受卵巢內(nèi)存留的卵泡數(shù)量和質(zhì)量影響。若卵巢內(nèi)存留的可募集卵泡數(shù)目減少、卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，導(dǎo)致生育能力降低或出現(xiàn)過早絕經(jīng)傾向，稱為卵巢儲(chǔ)備功能降低(Diminished Ovarian Reserve，DOR)，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)量少、月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕等。DOR在女性不孕因素中約占10%[1]，通常受年齡、遺傳、手術(shù)、免疫功能異常及環(huán)境等因素的影響。DOR女性不僅受孕率低，活產(chǎn)率也很低[2]，常規(guī)治療策略有應(yīng)用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑、激素替代療法和輔助生殖技術(shù)，但治療效果常常不令人滿意，因此改善DOR導(dǎo)致的不孕癥成為生殖領(lǐng)域的一項(xiàng)難題。既往有關(guān)DOR的研究主要集中于尋找預(yù)測(cè)及評(píng)估卵巢功能的有效指標(biāo)[3]，對(duì)DOR干預(yù)策略研究較少。

富血小板血漿(Platelet-Rich Plasma，PRP)治療對(duì)DOR或許是一個(gè)很好的選擇。PRP是將動(dòng)物或人的全血經(jīng)過離心后得到的富含高濃度血小板的血漿，其血小板及生長(zhǎng)因子濃度約為自體血漿的3～5倍，PRP在醫(yī)學(xué)其他領(lǐng)域已有一些研究及應(yīng)用[4]。由PRP產(chǎn)生的多種生長(zhǎng)因子通過調(diào)控多種信號(hào)通路影響細(xì)胞的分化、增殖等生物學(xué)功能[5]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，卵巢內(nèi)注射PRP可改善DOR患者的激素水平，增加其卵母細(xì)胞數(shù)量，改善卵巢功能并獲得更好的生育結(jié)局[6-7]。

DOR與顆粒細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的主要原因[8]；且凋亡率越高，出現(xiàn)空卵泡概率越高，卵母細(xì)胞和胚胎的質(zhì)量也越差[9]。一項(xiàng)前瞻性臨床試驗(yàn)顯示，與卵巢儲(chǔ)備正常的女性相比，DOR女性的顆粒細(xì)胞凋亡率顯著增加，且與卵巢反應(yīng)、卵母細(xì)胞產(chǎn)量、MⅡ獲卵數(shù)、雙原核(2PN)卵裂數(shù)、D3優(yōu)胚數(shù)、囊胚形成率、冷凍胚胎數(shù)等參數(shù)呈負(fù)相關(guān)[10]。因此本研究通過體外培養(yǎng)DOR患者卵丘顆粒細(xì)胞，探究PRP對(duì)DOR患者卵丘顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為DOR的臨床治療提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象及樣本收集

選取2020年8月至2021年9月在青島婦女兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行常規(guī)IVF/ICSI-ET治療的DOR不孕癥患者82例，收集每一例患者的卵丘顆粒細(xì)胞，并將所獲細(xì)胞平均分為PRP組(使用激活的PRP+培養(yǎng)液培養(yǎng))和對(duì)照組(僅使用培養(yǎng)液培養(yǎng))，用于后續(xù)研究。

DOR目前尚無被臨床廣泛認(rèn)可且統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，本研究將2011年歐洲人類胚胎與生殖學(xué)會(huì)發(fā)表的卵巢低反應(yīng)(POR)共識(shí)(博洛尼亞共識(shí))中對(duì)卵巢儲(chǔ)備功能異常的描述作為本次研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)：血清抗苗勒管激素(AMH)<1.1 ng/ml或基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)<5～7個(gè)[11]；同時(shí)體質(zhì)量指數(shù)(BMI)<25 kg/m2、基礎(chǔ)體溫呈雙相型、血清泌乳素水平在正常范圍、受試前6個(gè)月未服用過激素類藥物、無卵巢手術(shù)史。排除標(biāo)準(zhǔn)：多囊卵巢綜合征患者、子宮內(nèi)膜異位癥患者、內(nèi)分泌疾病以及盆腔結(jié)核患者。

本研究經(jīng)青島婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過，所涉及的患者均已充分告知并簽署知情同意書，且本研究所收集的樣本均為醫(yī)療遺棄物，對(duì)患者無影響。

二、材料

1.主要試劑和儀器：主要試劑：卵泡刺激素受體(FSHR)抗體(22665-1-AP，Proteintech，美國)；細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8試劑盒)(CA1210，北京索萊寶)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(A111，南京諾唯贊)；凝血酶(來源于牛血漿)(AS00254，Sigma，美國)；血液保存液(威海潔瑞)；DEME-F12培養(yǎng)基(山東思科捷)；RNA快速提取試劑盒(AC0201，山東思科捷)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(AG0304，山東思科捷)；SYBR Green qPCR試劑盒(AG11702，湖南艾科瑞)；qRT-PCR引物由北京擎科生物科技有限公司合成，具體信息見表1；Bcl-2抗體(兔，A0208)、Ki-67抗體(兔，A2094)、Bax抗體(兔，A15646)均自武漢愛博泰克；鼠抗山羊IgG二抗(A23410)、兔抗山羊IgG二抗(A23230)購自武漢Abbkine；雌二醇檢測(cè)試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)購自上海羅氏。

主要儀器：Quant StudioTM5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(C480，Roche，美國)；熒光顯微鏡(BX51，日本Olympus)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio Tek，美國)；羅氏全自動(dòng)發(fā)光儀(COBAS600，上海羅氏)。

表1 qRT-PCR引物序列

2.細(xì)胞株：人卵巢顆粒細(xì)胞(KGN細(xì)胞)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

三、研究方法

1.人卵丘顆粒細(xì)胞的獲取：DOR患者注射HCG扳機(jī)后36 h，在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺抽吸直徑≥14 mm的卵泡，對(duì)獲取的卵母細(xì)胞-卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物(COC)機(jī)械分割后獲取卵丘顆粒細(xì)胞，PBS清洗3遍，使用0.1%的透明質(zhì)酸酶消化并反復(fù)吹打，使細(xì)胞團(tuán)分散為單個(gè)細(xì)胞。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：將上述顆粒細(xì)胞均分為PRP組和對(duì)照組，置于96孔板中于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。PRP組使用激活的PRP(1%)+含10%胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培養(yǎng)基(共100 μl)培養(yǎng)；對(duì)照組僅使用含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基(共100 μl)培養(yǎng)。KGN細(xì)胞的培養(yǎng)液和培養(yǎng)環(huán)境與對(duì)照組相同。

3.PRP的制備與激活：征集5名健康成人志愿者，每人采集肘前靜脈全血17.5 ml均分至2支15 ml的離心管(每管含1.25 ml枸櫞酸鈉抗凝劑)，輕輕搖晃混勻。室溫300g離心20 min，小心吸取上層淡黃色部分及上下層連接處部分至新管，300g離心20 min后留取最底層1 ml液體，即PRP。參照之前文獻(xiàn)[12]方法使用PBS將血小板濃度調(diào)整為1×109/ml，與10%的CaCl2、凝血酶按9∶1的體積比混勻，于37℃培養(yǎng)箱孵育4 h激活，室溫下2 000g離心10 min，使用0.22 μm過濾器過濾、分裝，凍存于-80℃冰箱備用。

4.CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖：使用含有10%FBS的培養(yǎng)基將KGN細(xì)胞濃度調(diào)整至1×104/ml后均勻接種到96孔板中；PRP濃度梯度設(shè)置為0、1%、2%、5%及10%，DMEM-F12培養(yǎng)基中FBS濃度梯度設(shè)置為0、2%、5%及10%，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔100 μl，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h及120 h時(shí)的細(xì)胞增殖情況。調(diào)整人卵丘顆粒細(xì)胞濃度至1×104/ml后均勻接種到96孔板中；將PRP濃度梯度設(shè)置為0、1%，F(xiàn)BS濃度梯度設(shè)置為0、10%，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔100 μl，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)0 h、24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖情況。測(cè)定時(shí)，每孔均加入10 μl CCK-8溶液，在37℃避光孵育2 h，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度(OD)值，將僅添加培養(yǎng)液孔的OD值作為對(duì)照調(diào)零，結(jié)果取3孔OD平均值，并以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

5.TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將分組、處理后的人卵丘顆粒細(xì)胞分別均勻涂片、標(biāo)記、固定，按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書處理細(xì)胞后于熒光顯微鏡下觀察、拍照。每樣本隨機(jī)選取3張圖像，計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞率(TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI染色細(xì)胞數(shù))并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

6.qRT-PCR檢測(cè)人卵丘顆粒細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)：使用微量樣品RNA快速提取試劑盒提取樣本RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照SYBR Green qPCR試劑盒說明書完成上樣，使用Quant StudioTM5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，使用相對(duì)定量法檢測(cè)Bax和Bcl-2基因的相對(duì)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用軟件自帶分析工具或按照2-△△CT式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

7.細(xì)胞免疫熒光染色：用胰酶消化細(xì)胞5 min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，300g離心5 min，吸棄上清后PBS清洗2遍，加入適量多聚甲醛固定，涂片，PBS漂洗后，使用0.5% Triton X-100室溫通透 20 min，PBS漂洗后烘干，滴加山羊血清室溫封閉1 h，后于4℃濕盒過夜孵育一抗(1∶100)。PBS漂洗后，常溫、避光環(huán)境下孵育熒光二抗(1∶400)1 h。復(fù)染色時(shí)使用DAPI或Hoechst避光染色10 min。PBS漂洗后封片，于熒光顯微鏡下觀察、拍照。測(cè)定Bax、Bcl-2和Ki-67時(shí)每樣本隨機(jī)選取3張圖像，使用Image J軟件(NIH，美國)處理，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度(該區(qū)域熒光強(qiáng)度總和/該區(qū)域面積)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

FSHR作為特異性表達(dá)于顆粒細(xì)胞胞質(zhì)的蛋白，常被用作分子標(biāo)志物以鑒定顆粒細(xì)胞[13]。本研究中顆粒細(xì)胞的鑒定即通過細(xì)胞免疫熒光法觀察FSHR的表達(dá)。

8.E2濃度檢測(cè)：備存的PRP組和對(duì)照組卵丘顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液以300g離心5 min后吸取上清，于青島婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科通過羅氏全自動(dòng)發(fā)光儀檢測(cè)E2濃度。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、顆粒細(xì)胞的觀察和鑒定

為確定所使用的細(xì)胞為顆粒細(xì)胞，本研究使用倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，鏡下可見細(xì)胞呈梭形、橢圓形等，表面可見黑色的顆粒狀物質(zhì)，認(rèn)為符合顆粒細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，如圖1A、B所示。

使用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)顆粒細(xì)胞FSHR的表達(dá)，熒光顯微鏡下可見人卵丘顆粒細(xì)胞胞質(zhì)和KGN細(xì)胞胞質(zhì)中有較強(qiáng)熒光，如圖1C示，符合人顆粒細(xì)胞的分子特征。

A：KGN細(xì)胞不同時(shí)間的生長(zhǎng)狀態(tài)；B：人卵丘顆粒細(xì)胞不同時(shí)間的生長(zhǎng)狀態(tài)；C：使用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)顆粒細(xì)胞中FSHR的表達(dá)，可見人卵丘顆粒細(xì)胞胞質(zhì)和KGN細(xì)胞胞質(zhì)中有較強(qiáng)的紅色熒光。圖1 人顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及鑒定(×10)

二、不同濃度PRP的顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)情況

為探究體外培養(yǎng)時(shí)顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)的最適PRP和FBS濃度，使用CCK-8法檢測(cè)KGN細(xì)胞在不同PRP、FBS濃度下的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，適當(dāng)濃度的PRP可促進(jìn)細(xì)胞增殖(圖2A、B、C、D)。無FBS時(shí)，不同濃度的PRP均可促進(jìn)細(xì)胞增殖，其中10%PRP下KGN生長(zhǎng)較好(圖2A)；在FBS為2%、5%及10%時(shí)，均為加入1%PRP的KGN生長(zhǎng)趨勢(shì)較好(圖2B、C、D)。不同濃度的FBS和PRP相比，10%FBS+1%PRP的KGN生長(zhǎng)最好(圖2D)。隨后我們使用CCK-8法對(duì)人卵丘顆粒細(xì)胞在不同PRP、FBS濃度下的增殖情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果大致相同(圖2E、F)。因此選擇10%FBS+1%PRP(即PRP組所用濃度)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A：0%FBS時(shí)不同濃度的PRP培養(yǎng)KGN的生長(zhǎng)曲線，加入PRP后均促進(jìn)KGN增殖，10%PRP濃度時(shí)KGN生長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)更好；B、C、D：2%、5%、10%FBS時(shí)不同濃度的PRP培養(yǎng)KGN的生長(zhǎng)曲線，可見1%PRP濃度下KGN生長(zhǎng)趨勢(shì)較好；圖E、F：0%和10%FBS時(shí)不同濃度PRP培養(yǎng)人卵丘顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，加入1%PRP均促進(jìn)人卵丘顆粒細(xì)胞增殖，48 h內(nèi)10%FBS+1%PRP時(shí)細(xì)胞增殖趨勢(shì)最好；與0%PRP比較，*P<0.05。圖2 不同濃度的FBS和PRP下KGN細(xì)胞和人卵丘顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖

三、PRP在體外培養(yǎng)中可抑制卵丘顆粒細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖

為探究PRP對(duì)卵丘顆粒細(xì)胞凋亡的影響，使用TUNEL法檢測(cè)30例DOR患者卵丘顆粒細(xì)胞24 h、48 h及72 h時(shí)的凋亡情況(每個(gè)時(shí)間段各10例)。結(jié)果顯示，PRP組卵丘顆粒細(xì)胞凋亡率(TUNEL陽性細(xì)胞率)均顯著低于對(duì)照組(P<0.001)(圖3)。

使用qRT-PCR檢測(cè)20例DOR患者卵丘顆粒細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PRP組的凋亡基因Bax表達(dá)顯著降低，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)顯著升高(P<0.01)(圖4)。且30例DOR患者卵丘顆粒細(xì)胞的免疫熒光染色(用熒光強(qiáng)度表示蛋白相對(duì)表達(dá)量)也驗(yàn)證了這一結(jié)果，與對(duì)照組相比，PRP組中凋亡蛋白Bax表達(dá)量顯著降低(P<0.001)(圖5A)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著升高(P<0.001)(圖5B)。PRP在體外培養(yǎng)中不僅抑制卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡，還可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，除CCK-8法證實(shí)PRP可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖(圖2)外，本研究還對(duì)32例DOR患者的卵丘顆粒細(xì)胞進(jìn)行增殖因子Ki-67蛋白的免疫熒光染色，結(jié)果顯示，PRP組Ki-67蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.001)(圖5C)，再次驗(yàn)證了PRP促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

A：24 h、48 h、72 h細(xì)胞凋亡免疫熒光成像：TUNEL：TUNEL染色呈紅色；DAPI：細(xì)胞核染色呈藍(lán)色；Merge：合并圖(凋亡細(xì)胞呈粉色)；B：24 h、48 h、72 h對(duì)照組和PRP組的TUNEL陽性細(xì)胞率(每個(gè)時(shí)間段各10例)；C：24 h、48 h、72 h對(duì)照組和PRP組細(xì)胞凋亡率比較(n=10)：與對(duì)照組比較，***P<0.001。圖3 TUNEL法檢測(cè)DOR患者卵丘顆粒細(xì)胞凋亡

A：PRP組和對(duì)照組中凋亡基因Bax相對(duì)表達(dá)量(n=20)，與對(duì)照組比較，***P<0.001；B：PRP組和對(duì)照組中抗凋亡基因Bcl-2相對(duì)表達(dá)量(n=20)，與對(duì)照組比較，**P<0.01。圖4 qRT-PCR檢測(cè)DOR患者卵丘顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因

四、PRP在體外培養(yǎng)中可增強(qiáng)卵丘顆粒細(xì)胞的分泌功能

對(duì)30例DOR患者卵丘顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的E2濃度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，PRP組E2濃度顯著增高(P<0.001)(圖6)。

A：PRP組和對(duì)照組凋亡蛋白Bax的表達(dá)：左側(cè)圖中Bax免疫熒光染色為綠色，細(xì)胞核的DAPI染色為藍(lán)色；與對(duì)照組比較，***P<0.001。B：PRP組和對(duì)照組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)：左側(cè)圖中Bcl-2免疫熒光染色為粉色，細(xì)胞核的DAPI染色為藍(lán)色；與對(duì)照組比較，***P<0.001。C：PRP組和對(duì)照組增殖因子Ki-67的表達(dá)：左側(cè)圖中Ki-67免疫熒光染色為綠色，細(xì)胞核的DAPI染色為藍(lán)色；與對(duì)照組比較，***P<0.001。圖5 免疫熒光染色法檢測(cè)卵丘顆粒細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子與增殖因子的表達(dá)

A：PRP組與對(duì)照組中E2濃度分布；B：PRP組與對(duì)照組中E2濃度比較：與對(duì)照組比較，***P<0.001。圖6 羅氏全自動(dòng)發(fā)光儀檢測(cè)卵丘顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的E2濃度

討 論

卵巢顆粒細(xì)胞包括壁層顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞，其中卵丘顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞關(guān)系密切，緊緊圍繞在卵母細(xì)胞周圍[14]，影響卵泡的增殖和凋亡[15]。卵丘顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)可促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，提高體外受精治療周期中的胚胎著床率和妊娠率[14，16-17]。因此卵丘顆粒細(xì)胞的功能與狀態(tài)對(duì)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等，參與卵泡發(fā)育的不同階段[18]。DOR患者卵泡的質(zhì)量和/或數(shù)量較正常人顯著降低，既往研究發(fā)現(xiàn)DOR患者顆粒細(xì)胞的高凋亡是卵泡閉鎖的主要原因[8]，且對(duì)生育力有負(fù)面影響[9]。

PRP是外周血液離心后獲得的含有高濃度血小板的血漿[5]，激活血小板中的α顆粒會(huì)釋放多種生物活性蛋白，包括血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等[5，19]，可刺激細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和分化[20]。近年來，PRP治療作為一種新型的治療方法，在其他臨床領(lǐng)域已有較多應(yīng)用。有研究證明存在于PRP中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、血清生長(zhǎng)分化因子(GDF)和激活素可調(diào)節(jié)多種卵巢功能[21]。例如，在卵泡發(fā)生的早期，激活素通過kit配體/c-Kit途徑和smad2/smad3信號(hào)通路促進(jìn)卵母細(xì)胞的存活和原始卵泡的形成[22]；BMP7和BMP4可調(diào)節(jié)原始卵泡的募集，并促進(jìn)原始卵泡向初級(jí)卵泡的轉(zhuǎn)變[23]；GDF-9對(duì)于初級(jí)階段后的卵泡生長(zhǎng)至關(guān)重要，可通過抑制顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖來使卵泡存活[24]。已有一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，PRP激活后釋放的生長(zhǎng)因子在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用[25]，將PRP直接注射到卵巢治療后的小鼠在卵巢各個(gè)階段的卵泡數(shù)量及質(zhì)量都得到了提高[26]，且小鼠卵巢皮質(zhì)體積增加[27]。臨床上一項(xiàng)前瞻性實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道在卵巢內(nèi)注射PRP的DOR患者臨床妊娠率和活產(chǎn)率更高[28]，陳琪琦等[29]對(duì)卵巢早衰女性進(jìn)行經(jīng)陰道卵巢注射PRP后發(fā)現(xiàn)，患者血漿中E2水平較前增加，F(xiàn)SH水平較前降低。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)陰道卵巢內(nèi)注射PRP可以在一定程度上改善患者卵巢功能并成功獲得生育[7，30-31]。因此，本研究通過體外培養(yǎng)DOR患者的卵丘顆粒細(xì)胞，給予不同濃度的PRP，探討激活后的PRP對(duì)卵丘顆粒細(xì)胞凋亡和增殖的影響。因FBS廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)也可作為卵母細(xì)胞體外成熟卵泡液的替代品[32]，因此本研究在顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)常規(guī)給予了FBS。

本研究使用CCK-8法測(cè)定并驗(yàn)證了PRP可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖的功能，且最適濃度為1%，以該濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將DOR患者的卵丘顆粒細(xì)胞分為PRP組和對(duì)照組，使用Tunel染色后，發(fā)現(xiàn)PRP組患者卵丘顆粒細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組(P<0.001)；qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PRP組中凋亡基因Bax表達(dá)顯著低于對(duì)照組，抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.001)；使用細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)兩組中Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)得到了一致的結(jié)果，同時(shí)增殖因子Ki-67蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高(P<0.001)；經(jīng)羅氏全自動(dòng)發(fā)光儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PRP組卵丘顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的E2濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。上述結(jié)果均提示體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，激活的PRP可抑制DOR患者卵丘顆粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其增殖，同時(shí)增強(qiáng)其分泌功能，使E2水平升高。但本研究尚存在一定的局限性和不足，本研究?jī)H在細(xì)胞、RNA、蛋白質(zhì)層面對(duì)PRP的有效性進(jìn)行了探究，未行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和機(jī)制的探索，后續(xù)需進(jìn)一步的研究和探討。

綜上所述，體外培養(yǎng)人卵丘顆粒細(xì)胞時(shí)，給予激活的PRP能有效抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其增殖，同時(shí)增強(qiáng)其分泌功能；這為PRP治療DOR患者的臨床應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。