黃嫦嫦，殷偉蔚，金敏，封純*

(1.浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院，杭州 310009；2.杭州市臨平區(qū)第一人民醫(yī)院婦科，杭州 311100)

隨著腫瘤診斷和治療技術(shù)的發(fā)展，腫瘤患者的生存率明顯提高，但腫瘤治療中的化療和放療可能會破壞女性卵巢儲備功能，導致不孕不育、更年期癥狀、骨質(zhì)疏松和內(nèi)分泌功能障礙等，從而降低女性的生育力和生活質(zhì)量。目前，胚胎冷凍、卵母細胞冷凍是可行的生育力保存方式，但有一些腫瘤患者因病情不允許或青春期前的女性不能進行促排卵治療而不能使用該技術(shù)[1]。此外，胚胎冷凍、卵母細胞冷凍技術(shù)局限于腫瘤治療后可恢復生育能力的患者，其并不能改善因卵巢功能減退導致其他副作用的患者的生育需求。為解決上述問題，有研究者采用放、化療前凍存卵巢組織，腫瘤治愈后再植入的方法保存生育力。有研究發(fā)現(xiàn)，凍融卵巢組織移植術(shù)后可獲得妊娠或者活產(chǎn)[2]。目前，凍融卵巢組織移植術(shù)的活產(chǎn)率可達到35%以上[3]。

盡管卵母細胞沒有引入腫瘤的風險，但周邊卵巢組織可能被侵犯，如血液淋巴系統(tǒng)及卵巢的惡性腫瘤可能將癌細胞重新引入體內(nèi)，所以，更安全的方法是構(gòu)建人工卵巢(artificial ovary)。Laronda等[4]通過3維(3D)打印技術(shù)將明膠制成生物支架，在支架中植入卵泡后分別移植到9只小鼠體內(nèi)，隨后在7個人工卵巢中發(fā)現(xiàn)了存活的卵泡，且卵泡分泌激素刺激乳汁生成，提示人工卵巢具有生育力保存和維持正常內(nèi)分泌的功能，也證明組織工程學與生殖醫(yī)學的結(jié)合是未來發(fā)展的可行方案。Pors等[5]通過去除人卵巢組織中易造成癌細胞生長的成分，制作出“脫細胞支架”，再將未成熟的人和小鼠卵泡與其整合后移植到雌性小鼠中，發(fā)現(xiàn)大約有25%的人類和小鼠卵泡可以恢復活性，這標志著人類卵泡首次在“脫細胞支架”上存活下來。由此推斷，人工卵巢可能解決腫瘤患者的生育問題并提高生活質(zhì)量。

一、人工卵巢簡介

人工卵巢是指在生物材料構(gòu)成的半固體3D骨架結(jié)構(gòu)內(nèi)種植未成熟卵泡、卵巢基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞后形成的復合物[6-7]。其常用的生物材料包括藻酸鹽、殼聚糖、細胞外基質(zhì)、纖維蛋白、透明質(zhì)酸、膠原蛋白、聚乙二醇(PEG)等[8]。人工卵巢移植入生物體內(nèi)后，未成熟卵泡可發(fā)育成熟并分泌性激素?；颊呖梢赃x擇冷凍保存卵巢組織或整個卵巢，需要妊娠時從解凍的卵巢組織中分離卵泡，放置在配有生長因子、內(nèi)皮細胞和卵巢基質(zhì)細胞的支架中構(gòu)建人工卵巢。人工卵巢移植成功后，卵母細胞為后續(xù)的生殖過程提供配子，顆粒細胞和卵泡細胞提供雌性類固醇激素[9]。

二、人工卵巢的制作過程

1.卵巢組織的獲取及冷凍保存：切除多少卵巢組織主要與未來的治療計劃和現(xiàn)有的卵巢容積相關(guān)。由于大多數(shù)卵泡位于卵巢皮質(zhì)中，少量的卵巢皮質(zhì)組織足以進行生育力保存，但如果患者喪失生育能力的風險很高，冷凍保留整個卵巢可以確保獲得最大數(shù)量的原始卵泡，為后續(xù)治療提供更多的機會[10]。

目前，用于卵巢組織冷凍的方法有程序化慢速冷凍和玻璃化快速冷凍兩種(表1)。關(guān)于卵巢組織低溫保存的最佳技術(shù)還沒有達成共識，但是，目前已獲得活產(chǎn)的病例都是采用程序化慢速冷凍保存[11]。研究表明，程序化慢速冷凍在原始卵泡保存、卵泡細胞增殖、血管生成、抗苗勒管激素表達和脫氧核糖核酸損傷方面均優(yōu)于玻璃化快速冷凍[12]。但就整個卵巢而言，冷凍過程中細胞內(nèi)、外冰晶的形成，特別是血管內(nèi)冰晶的形成會破壞器官的結(jié)構(gòu)并損害其功能。冷卻速率也受到冷凍器官尺寸和幾何形狀的限制，冷卻所需的低溫很難在有限時間內(nèi)均勻地傳遞給所有細胞，所以，目前還沒有最有效的冷凍保存方案[13]。至今為止，冷凍小塊卵巢組織以防止卵泡丟失和損傷是比較理想的選擇。

表1 程序化慢速冷凍和玻璃化快速冷凍方法比較

2.卵泡的分離和選擇：目前，機械法、酶法和機械/酶結(jié)合法廣泛用于從卵巢組織中分離卵泡。其中，機械法(手動攪拌器或手術(shù)刀)分離卵泡能保持卵泡基底膜的完整性但獲卵率相對較低。酶法獲卵率較高，但卵泡的基底膜損傷，卵泡發(fā)育欠佳。大多數(shù)原始卵泡分布在卵巢皮層纖維中，將機械法和酶法結(jié)合消化卵巢皮質(zhì)可獲得較高的獲卵率且獲得的卵泡質(zhì)量高，此法在臨床較為常用[8]。目前，形態(tài)正常和顆粒細胞層完整的存活卵泡的回收率仍然不盡如人意。研究發(fā)現(xiàn)，用Lymphosep分離液進行顆粒細胞分離，使得獲取卵泡更可行，成本更低[14]。惡性腫瘤患者的卵巢組織行卵泡分離時需重點關(guān)注的問題是惡性細胞可能污染懸浮液。Soares等[15]設(shè)計了一種洗滌步驟，將分離的卵泡從一個液滴轉(zhuǎn)移到另一個液滴，從而將其與周圍細胞分離，在分離前66%的卵巢組織和消化的卵巢懸浮液中可檢測到白血病細胞，分離后所有的卵泡樣本的白血病細胞檢測結(jié)果均呈陰性。有研究表明，人工卵巢中移植次級卵泡的卵泡生存率和生長率均優(yōu)于移植原始卵泡[16]。

3.卵巢基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞：卵泡的生存和生長取決于卵泡與周圍卵巢細胞和細胞外基質(zhì)之間的對話，早期卵泡的發(fā)育是由卵泡和卵巢基質(zhì)的卵巢自分泌/旁分泌調(diào)節(jié)控制的。在原始卵泡激活后，原始卵泡分泌因子從卵巢基質(zhì)招募成纖維細胞樣前體細胞或干細胞并分化成功能細胞，基質(zhì)細胞的缺乏可能影響卵泡的存活[5]。因此，卵巢基質(zhì)細胞與人工卵巢的結(jié)合可重建卵泡與周圍基質(zhì)細胞之間的交互，促進卵泡發(fā)育[17]。內(nèi)皮細胞負責卵巢組織的血管重建，運輸旁分泌因子、氧和營養(yǎng)物質(zhì)以及去除代謝廢物，提高移植后的血運重建有助于多種細胞的存活。內(nèi)皮細胞可以在患者完成化療、放療后從新鮮的卵巢活檢組織中分離出來，化療并不影響細胞行為[18]。聯(lián)合使用新鮮卵巢髓質(zhì)組織的基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞與卵泡聯(lián)合移植，可以提高人工卵巢的效率[18-19]。另外，小鼠脂肪來源干細胞與早期卵泡的共包埋，有助于顆粒細胞和卵膜細胞的功能和存活，促進卵泡發(fā)育[20]。

4.人工卵巢的支架：卵泡3D培養(yǎng)采用以生物材料為基礎(chǔ)的支架，對維持卵泡的球形結(jié)構(gòu)具有重要的作用。生物功能化的3D支架通過維持3D卵泡結(jié)構(gòu)、細胞間相互作用和旁分泌信號傳導來模擬自然卵巢環(huán)境，誘導卵泡發(fā)育[21]。理想情況下，支架植入后應具有生物相容性和可降解性，不影響卵泡的生長和運動，并通過提供氧氣和營養(yǎng)促進新生血管形成[22]。從廣泛的生物材料中選擇一種適合人工卵巢的生物材料是具有挑戰(zhàn)性的。卵巢支架成分依賴于卵泡發(fā)育階段和特異性，該材料必須復制相應的功能性卵泡周圍細胞外基質(zhì)，并尊重卵巢組織的異質(zhì)性，以保證其生物模擬性[23]。在研究了膠原蛋白、纖維蛋白、血漿凝塊、藻酸鹽、殼聚糖水凝膠、脫細胞化卵細胞外基質(zhì)等天然聚合物和合成聚合物如PEG后，提示合成材料在降解率和機械性能方面更穩(wěn)定[17]，而天然聚合物在細胞粘附、遷移、增值和分化等方面更有優(yōu)勢，進一步通過天然聚合物與合成聚合物相結(jié)合而獲得混合聚合物水凝膠[24]，相關(guān)研究的具體信息見表2。

表2 人工卵巢基質(zhì)材料及相關(guān)研究

三、人工卵巢的植入及監(jiān)測

1.人工卵巢移植部位及注意事項：人工卵巢的移植部位包括原位(盆腔、卵巢、腹膜窗)移植和異位(前臂、頸部、直肌)移植[9]。原位移植在輸卵管保持完整及人工卵巢適當定位的情況下可以實現(xiàn)自然妊娠，而異位移植無法自然妊娠[27]。人工卵巢原位移植為卵泡發(fā)育提供了良好的環(huán)境，有病例報告證明原位移植是有效的[32]。人工卵巢進行異位移植時，應考慮患者的體溫、血壓、旁分泌因素和血液供應的差異[33]。異位移植移植過程相對簡單，重復移植的成本更低。

人工卵巢移植手術(shù)后面臨的主要問題是免疫排斥反應和缺血性損傷。人工卵巢支架生物材料的免疫反應仍然是一個值得注意的問題，支架設(shè)計應考慮緩解免疫反應。移植后機體血管生成和微循環(huán)灌注的時效性對人工卵巢的存活和功能恢復至關(guān)重要[34]。移植后超聲靶向破壞微泡可增加血管生成，通過引起毛細血管內(nèi)皮損傷造成短暫的炎癥反應來增加血流灌注[35]。圍手術(shù)期使用促紅細胞生成素可促進有效血液運輸系統(tǒng)的重建[36]。除此之外，血管生成生物材料、內(nèi)皮細胞、血管內(nèi)皮生長因子、維生素E、促性腺激素、褪黑素的使用可能改善人工卵巢的移植結(jié)局[37-38]。

2.評估與監(jiān)測：在進行生育力保存手術(shù)之前，可以通過檢測血清激素水平、B超評估卵巢體積、竇卵泡數(shù)及卵巢組織活檢等方式評估卵巢儲備功能。在解凍和移植卵巢組織后，可通過形態(tài)學評估和免疫組織化學了解解凍后和移植后的卵泡情況[38]。當人工卵巢應用于臨床時，通過監(jiān)測C-反應蛋白水平、CD4/WBC計數(shù)評估移植后的炎癥免疫反應，通過血清激素水平和超聲成像評估卵泡發(fā)育情況，通過多光譜光聲層析成像選擇有活力的卵母細胞[39]。此外，確認卵泡內(nèi)卵母細胞的遺傳信息在生育力保存過程中沒有被改變非常重要，可在移植前、體內(nèi)成熟和誘導后對卵母細胞分別進行遺傳信息核對。

四、人工卵巢的應用前景

對于不能移植解凍卵巢組織的腫瘤患者以及卵巢功能衰竭患者，可以通過移植人工卵巢恢復生育能力并提高生活質(zhì)量。人工卵巢提供了一個合適的微環(huán)境來研究卵巢干細胞，并評估它們重啟人類配子發(fā)生的能力，也有助于理解卵泡發(fā)生過程。且人工卵巢在毒理學研究中可以為各類藥物臨床試驗提供新的試驗體，以闡明不同藥物對生殖的影響。隨著人工卵巢中卵巢細胞基質(zhì)的制作技術(shù)發(fā)展，該技術(shù)可以擴展到制造其他人工器官。

一般患者自身冷凍卵巢組織的卵泡可以成為配子的來源，而卵巢早衰患者需要采用捐贈的卵母細胞或其他替代來源，各種來源的干細胞也可成為配子重要的儲備。除了胚胎干細胞、誘導多能干細胞，還包括兩種在成年哺乳動物卵巢表面上皮中發(fā)現(xiàn)的具有高核質(zhì)比的球形干細胞：即微小胚胎樣干細胞和卵巢生殖干細胞，也可作為卵母細胞的其他潛在來源[32]。另外，人卵巢卵泡液(human ovarian follicular fluid，HOFF)中含有蛋白質(zhì)、卵母細胞和顆粒細胞生長和成熟所必需的細胞外基質(zhì)。上皮細胞和干細胞可以從HOFF中分離出來，其在HOFF中的培養(yǎng)時間延長后，可以觀察到卵母細胞樣結(jié)構(gòu)，以上結(jié)果證明，從卵泡液中提取的細胞具有干細胞特征，這可能有助于再生醫(yī)學應用和細胞治療[40]。

五、社會和生物倫理問題

首先，人工卵巢技術(shù)特殊，且其非常重要的特征是疾病風險不僅涉及患者本人，還涉及子代。卵泡體外操作可能會導致卵母細胞的遺傳和表觀遺傳發(fā)生變化，這將直接影響子代健康。此外，惡性疾病常常是遺傳性的，人工卵巢技術(shù)可能將與惡性腫瘤相關(guān)的遺傳變異傳給下一代，人為增加惡性腫瘤患者的占比[41]。其次，如果將人工卵巢的應用范圍擴展到非腫瘤患者身上，問題就會變得更加復雜，人工卵巢可能成為因職業(yè)或個人原因而推遲生育的方法，但也可能成為遺傳操縱工具[32]。除此之外，仍有許多問題需要考慮，如人工卵巢技術(shù)是否應該有年齡限制？如果患者已經(jīng)有了孩子，是否允許再移植？人工卵巢是否影響患者的身心健康？資源如何合理分配？等等。但不可否認的是，人工卵巢技術(shù)的發(fā)展將為生殖醫(yī)學領(lǐng)域的進步提供新的思路和方向。

六、小結(jié)

迄今為止，在動物研究和人體試驗中，人工卵巢可分泌激素并產(chǎn)生卵泡。然而，考慮到其臨床應用的遺傳安全性和有效性，還需要優(yōu)化設(shè)計人工卵巢支架、改良移植技術(shù)以防止術(shù)后缺血，并通過選擇合理的卵巢組織保存方式及更可靠的卵泡分離方法來提高卵泡的復蘇率。人工卵巢不僅為生育力保存帶來新希望，也為未來人口老齡化提供了新的生育儲備方式；還可能用于瀕臨滅絕物種的保護，維持生態(tài)多樣性；同時也可為再生醫(yī)學提供新的方向。如果未來人工卵巢可以實現(xiàn)臨床應用，可能成為組織和器官工程領(lǐng)域新的突破點。