喬磊，鄭彬彬，楊盼盼，陳文成，閆樂樂，王建剛，吳明遠

康立泰生物醫(yī)藥（青島）有限公司，山東 青島 266000

細胞因子是調(diào)控機體免疫反應(yīng)［1］，激活先天免疫的重要因子［2］，在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞內(nèi)白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）基因治療可通過抑制血管生成，將腫瘤細胞停滯在G0 ／ G1 期，并誘導(dǎo)凋亡［4］。

IL-12 是由p35、p40 兩個亞基共同組成的異源二聚體［5］，是刺激T 細胞生長，促進CD8+T 細胞記憶性，誘導(dǎo)CD4+T 輔助細胞向Th1 細胞轉(zhuǎn)化的重要介質(zhì)，此外，IL-12 可通過誘導(dǎo)干擾素γ（interferonγ，IFNγ）和腫瘤壞死因子-α 的產(chǎn)生，降低IL-4 對IFNγ的抑制，負性調(diào)節(jié)IL-10，轉(zhuǎn)化生長因子β1，從而促進免疫細胞腫瘤浸潤，改善免疫抑制微環(huán)境［6-7］。已有研究發(fā)現(xiàn)，IL-12 對黑色素瘤、結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤具有抑制腫瘤生長，減少腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［8］，并在多種動物模型中也具有明顯的抗腫瘤作用［9-12］。2017 年，F(xiàn)DA 批準pIL-12 為治療不可切除轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的罕見藥［13］。因此，IL-12 作為腫瘤免疫基因治療的候選基因受到越來越多的關(guān)注［14-17］。

本研究從Sartorius BIOSTAT B 10 L 生物反應(yīng)器工藝放大到GE WAVE25 50 L 生物反應(yīng)器，通過細胞生長、細胞代謝、蛋白質(zhì)質(zhì)量等對比研究分析，初步評估IL-12 表達工藝放大的可行性，為后續(xù)更大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株 CHO-DG44 細胞為本公司細胞庫保藏。

1.2 主要試劑及儀器 CD opti-CHO AGT、F-68、LGlutamine 和CHO CD Efficient Feed B 均購自美國Thermo Fisher 公司；NaHCO3購自德國Merck 公司；標準品R201805001 為本公司實驗室制備（來自BIOSTAT B 10 L 罐）并檢測標定批次；10 L 生物反應(yīng)器BIOSTAT B 和無菌接管機BioWelder?TC 購自德國Sartorius 公司；50 L 生物反應(yīng)器WAVE25 購自美國GE 公司；生化分析儀Cedex 購自瑞士Roche 公司；細胞計數(shù)儀IC1000 購自中國上海睿鈺生物科技有限公司；超高效液相色譜儀H-Class bio 購自美國Waters 公司；pH 計ST3100 購自美國奧豪斯公司。

1.3 反應(yīng)器條件 細胞接種密度和活率、細胞培養(yǎng)溫度、pH 控制、DO 控制兩種反應(yīng)器相同；初始培養(yǎng)體積和工作體積根據(jù)反應(yīng)器設(shè)計進行線性放大計算獲得；通氣策略根據(jù)廠家推薦獲得，同時根據(jù)DO實時值進行調(diào)節(jié)；攪拌轉(zhuǎn)速參考廠家推薦轉(zhuǎn)速，并根據(jù)每天細胞狀態(tài)適當調(diào)整。兩種反應(yīng)器的具體條件見表1。

表1 兩種反應(yīng)器的條件Tab.1 Conditions of two bioreactors

1.4 補料策略

1.4.1 CHO CD Efficient Feed B 補加策略 從培養(yǎng)第3 天開始，每天補加培養(yǎng)終體積5%的CHO CD Efficient Feed B 至發(fā)酵罐中，共補加8 d，補料質(zhì)量用天平定量，補料密度按1 g ／ mL 計算。

1.4.2 200 mmol ／ L L-Gln 補加策略 發(fā)酵第0 ～6天，根據(jù)生化分析儀檢測L-Glutamine 剩余量，計算L-Glutamine 補加量，補加至當天L-Glutamine 終濃度2 mmol ／ L。發(fā)酵第7 ～12 天，根據(jù)生化分析儀檢測L-Glutamine 剩余量，計算L-Glutamine 補加量，補加至當天L-Glutamine 終濃度3 mmol ／ L。

1.5 日常取樣檢測 發(fā)酵開始后每天取10 mL 細胞懸液，直接利用pH 計檢測pH，用IC1000 細胞計數(shù)儀檢測細胞密度和細胞活率，將細胞懸液130 × g 離心5 min，收集上清液，分裝至1.5 mL EP 管中，取1管，用生化分析儀進行葡萄糖（Gluc）、乳酸（Lac）、谷氨酰胺（L-Gln）、銨根離子（NH4+）含量檢測，留存5管作為留樣備用。

1.6 理化分析

1.6.1 非還原型SDS-PAGE 取第0 ～12 天上清液，按3 ∶1 體積比加入供試品緩沖液（非還原型），于旋渦振蕩器上充分混勻后，將供試品和標準品按預(yù)定順序加入4.5%濃縮膠-10%分離膠膠孔中，上樣蛋白總量10 μg 以上（避免供試品溢出至臨近泳道，防止交叉污染和供試品損失）。上樣完畢后，進行恒壓電泳，初始電壓為80 V，進入分離膠時調(diào)至120 ～140 V，整個跑膠時間約為100 min。電泳完畢后，染色，脫色，并拍照保存。

1.6.2 IL-12 含量檢測 采用反相超高效液相色譜法（reversed phase ultra high performance liquid chromatography，RP-UPLC）。用PBS 配制0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05 μg ／ μL 標準品各100 μL，繪制標準曲線。取第7 ～12 天發(fā)酵上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后備用。利用ACQUITY UPLC Protein BEH C4 Column，300 埃，1.7 μm 色譜柱，在Waters H-Class Bio 超高效液相色譜上進行檢測分析。

1.6.3 原液等電點檢測 打開冷凝水機預(yù)冷至15 ℃，在冷凝板上加2 mL 石蠟油或去離子水，取出膠，將膠表面完全擦干，放在冷凝板上，膠片下面不能有氣泡。使用濾紙片或上樣條對供試品和標準品進行上樣，上樣量約為20 μL，電泳到一半時上樣條撤去。CleanGel for IEF 的運行條件：預(yù)電泳電壓700 V、電流12 mA、功率8 W、時間20 min，上樣電壓500 V、電流8 mA、功率8 W、時間10 min，等點聚焦電壓2 000 V、電流12 mA、功率14 W、時間90 min，電泳完成染色脫色，并對膠進行拍照保存。

1.6.4 原液肽圖檢測 取3 k 膜濃縮管，用50 mmol／L碳酸氫銨溶液充分透析，取標準品和原液約200 μg，4 ℃，13 000×g 離心20 min，加入200 μL 50 mmol／L碳酸氫銨，4 ℃，1 500 × g 離心20 min，重復(fù)上述操作，加入4 μL 1 μg ／ μL Trypsin，用50 mmol ／ L碳酸氫銨補足體積至100 μL，37 ℃反應(yīng)20 h，加入1 μL 甲酸終止反應(yīng)，液相色譜儀檢測并記錄色譜圖。

1.7 收獲標準 培養(yǎng)至第12 天或Countstar 全自動細胞計數(shù)儀（臺盼藍拒染法）檢測細胞活率低于80%時收獲。

2 結(jié) 果

2.1 兩種反應(yīng)器培養(yǎng)的細胞生長代謝的比較

2.1.1 活細胞密度及細胞活率 兩種反應(yīng)器培養(yǎng)的細胞生長變化趨勢一致，培養(yǎng)第8 天進入平臺期，最高活細胞密度均在1.3 × 107cells ／ mL 左右，見圖1。細胞活率變化也一致，收獲當天細胞活率均在80%以上，見圖2。

圖1 兩種反應(yīng)器的活細胞密度曲線Fig.1 Viable cell density curves of two bioreactors

圖2 兩種反應(yīng)器的細胞活率曲線Fig.2 Viability curves of two bioreactors

2.1.2 pH 與10 L BIOSTAT B 相比，50 L WAVE25 pH 曲線較快降低至6.85，這是兩種反應(yīng)攪拌方式和通氣方式差異導(dǎo)致，但整體上pH 變化基本一致，且pH 值均在質(zhì)量控制范圍6.8 ～7.4 內(nèi)，見圖3。

圖3 兩種反應(yīng)器的pH 曲線Fig.3 pH curves of two bioreactors

2.1.3 L-Gln 和NH4+整個培養(yǎng)過程中，兩種反應(yīng)器的L-Gln 曲線變化較一致，均呈現(xiàn)先降低后穩(wěn)定在0.5 ～1.0 mmol ／ L 之間，見圖4。NH4+濃度隨培養(yǎng)時間的延長而累積，但二者全程均未超過14 mmol ／ L，遠低于內(nèi)控小于20 mmol ／ L 的要求，見圖5。50 L WAVE25 后期NH4+濃度較高是由于不用混合系統(tǒng)的傳質(zhì)效率差異導(dǎo)致的。

圖4 兩種反應(yīng)器的L-Gln 曲線Fig.4 L-Gln curves of two bioreactors

圖5 兩種反應(yīng)器的NH4+曲線Fig.5 NH4+curves of two bioreactors

2.1.4 Gluc 和Lac 兩種反應(yīng)器Gluc 和Lac 變化趨勢基本一致，Gluc 先降低，后期隨著補料的加入又上升，見圖6。Lac 前期升高，后期隨著細胞的消耗降低，見圖7。

圖6 兩種反應(yīng)器的Gluc 曲線Fig.6 Glucose curves of two bioreactors

圖7 兩種反應(yīng)器的Lac 曲線Fig.7 Lactate curves of two reactors

2.2 理化分析

2.2.1 非還原型SDS-PAGE 兩種反應(yīng)器在第10 ～12 天發(fā)酵上清液在標準品相對分子質(zhì)量約70 000處有對應(yīng)的目的蛋白條帶，且兩種反應(yīng)器發(fā)酵上清液中均未見異常條帶，見圖8。

圖8 兩種反應(yīng)器培養(yǎng)細胞上清液的SDS-PAGE 分析Fig.8 SDS-PAGE profiles of culture supernatants of cells in two bioreactors

2.2.2 IL-12 含量 RP-UPLC 分析顯示，兩種反應(yīng)器IL-12 蛋白表達量穩(wěn)定，從第7 ～12 天蛋白表達量逐漸積累，收獲時均在80 mg ／ L 左右，見表2。

表2 兩種反應(yīng)器的IL-12 含量（mg ／ L）Tab.2 IL-12 contents expressed in two bioreactors（mg ／ L）

2.2.3 原液等電點 兩種反應(yīng)器各3 批次收獲后純化獲得的原液，每批重復(fù)3 次上樣，等電點均在4.6 ～5.0 之間，見圖9。由于蛋白的等電點與其氨基酸序列和翻譯后修飾相關(guān)，表明放大前后目的蛋白質(zhì)量無顯著差異，相對保持穩(wěn)定。

2.2.4 原液肽圖 放大后WAVE25 收獲的目的蛋白肽圖譜峰形、出峰時間、峰高與標準品比較均一致，表明放大前后目的蛋白的一級結(jié)構(gòu)、蛋白修飾基團位點和修飾所占比例等質(zhì)量均無顯著差異，保持了較好的一致性。見圖10 和圖11。

圖10 BIOSTAT B 肽圖Fig.10 BIOSTAT B peptide map

圖11 WAVE25 肽圖Fig.11 WAVE25 peptide map

3 討 論

本研究在不同規(guī)模，不具有幾何相似性的兩種反應(yīng)器上初步探索了10 L 到50 L 放大的可行性，放大過程保持部分體積依賴性參數(shù)，如初始培養(yǎng)體積、補料體積等進行適當?shù)谋壤糯蟆２糠煮w積非依賴性參數(shù)，如初始接種密度、培養(yǎng)溫度、溶氧、pH等放大前后保持不變。研究結(jié)果表明，50 L 與10 L反應(yīng)器的細胞活率、密度及Gluc、Lac、L-Gln 和NH4+等代謝參數(shù)基本一致。其次，目的蛋白終產(chǎn)量均在80 mg ／ L 左右，SDS-PAGE 條帶一致性良好，相對分子質(zhì)量大小符合預(yù)期（70 000 左右）。最后，不同反應(yīng)器所得原液等電點均在4.6 ～5.0 之間，多批次間肽圖均與標準品肽圖相符，表明目的蛋白質(zhì)量一致性良好。

當前業(yè)內(nèi)工藝放大的方法通常是等P ／ V、等Kla或經(jīng)驗放大方法，這些方法通常要求放大前后反應(yīng)器具有幾何相似性，從而更好地計算放大前后相應(yīng)的控制參數(shù)。接種反應(yīng)器前一代種子的高密度、高活率、穩(wěn)定生產(chǎn)性能成為過程控制的關(guān)鍵，而接種反應(yīng)器前一代種子通常通過WAVE 灌流獲得，本研究從BIOSTAT B 10 L 放大到WAVE 50 L，目的蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量均未發(fā)生顯著變化，這為后續(xù)高密度接種提供了參考。

綜上所述，本研究采用經(jīng)驗放大法對不具有幾何相似性的兩種反應(yīng)器放大的可行性進行了初步探索，結(jié)果表明，該表達工藝能夠進行規(guī)模性放大，為后續(xù)高密度接種發(fā)酵及更大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。