陳平，張利娟 綜述，李娜 審校

嘉銘（固安）生物科技有限公司，河北 廊坊 065504

20 世紀80 年代發(fā)展起來的一種新型疾病治療方式——基因治療，是以改變或糾正人的遺傳物質為基礎，將人正?；蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^相應的載體導入人體靶細胞，以發(fā)揮糾正或補償有缺陷基因的作用，從而達到治療相應疾病的目的。病毒載體是基因治療中最常采用的工具之一。腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）載體因其轉染效率高［1］，安全性高［2］，已成為目前基因治療中應用最廣泛的病毒載體之一，特別是在2012 年，由荷蘭生物技術公司Uniqure 研發(fā)的第一個針對脂蛋白脂肪酶缺乏癥（lipoprotein lipase deficiency，LPLD）的基因藥物Glybera 通過歐盟認證，并獲得歐洲首個被推薦上市的基因治療藥物以來，AAV 載體作為基因治療的載體引起了越來越多研究者的關注。本文就AAV 的發(fā)現(xiàn)與生物學特性、重組AAV（rAAV）載體的設計、AAV 在臨床基因治療中的應用及其可能引發(fā)的不良反應作一綜述，并對目前該病毒載體存在的問題及今后的研究方向進行展望。

1 AAV 的發(fā)現(xiàn)與生物學特性

AAV 最初是以一種污染成分被發(fā)現(xiàn)的，目前已分離到13 種血清型：AAV1 ～AAV13。這13 種血清型在系統(tǒng)進化樹中的相似性和差異性見圖1。此外，這些血清型的AAV 在衣殼氨基酸序列水平上也有很大差異，見表1。

表1 血清型AAV1 ～AAV13 衣殼同源性比較（%）Tab.1 Homology of capsids of AAV serotypes 1 to 13（%）

圖1 AAV 系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of AAV

AAV 隸屬于細小病毒科依賴病毒屬，是一類微小、無被膜的線性單鏈DNA 病毒［3］。其基因組大小約4 700 bp，直徑20 ～26 nm。AAV 為一種缺陷型病毒，需要輔助病毒（腺病毒輔助功能基因包括E1a、E1b、E2a、E4orf6 和VA RNA，皰疹病毒輔助功能基因UL5、UL8、UL22、UL9 及調節(jié)蛋白ICP0、ICP4、ICP22［4］）等的存在，才能感染宿主細胞，產生新的病毒顆粒，無輔助病毒存在時，野生型AAV 只能整合到19 號染色體長臂上，形成潛伏感染，隨宿主細胞染色體復制而復制［3］。

AAV 基因組主要由反向重復序列（inverted terminal repeats，ITRs）和2 個ITR 之間的2 個開放閱讀框（open reading frame，ORF）組成，左側ORF 編碼Rep78、Rep68、Rep52 和Rep40，右側ORF 編碼3 個衣殼蛋白VP1（相對分子質量87 000）、VP2（相對分子質量72 000）、VP3（相對分子質量62 000）［3］。AAV 衣殼由60 個衣殼蛋白構成，排列成T = 1 的二十面體結構［5］。

2 rAAV 載體

rAAV 載體通常是將野生型AAV（Wt-AAV）中的rep 和cap 基因被用于研究的目的基因所取代，只保留AAV 基因組兩端的2 個ITRs。rAAV 載體作為目前最受歡迎的載體，相較于其他病毒載體的優(yōu)缺點見表2。

表2 不同病毒載體系統(tǒng)的比較Tab.2 Comparison of different viral vector systems

2.1 rAAV 載體的設計

目前關于rAAV 載體的設計主要集中在兩方面：一方面是關于rAAV 衣殼改造設計，另一方面是rAAV 載體構建的設計。

2.1.1 rAAV 衣殼的改造設計

自rAAVs 顯示出良好的臨床應用前景以來，人們試圖通過設計新型rAAV 衣殼來獲得其新的特性。衣殼改造的方法主要包括：自然發(fā)現(xiàn)、合理設計、定向改造和計算機生物信息學。

2.1.1.1 自然發(fā)現(xiàn) 如前所述，AAV 最初是作為一種細胞培養(yǎng)污染物被發(fā)現(xiàn)的，AAV2 是應用最為廣泛的血清型。相關文獻報道，最具臨床前景的載體血清型是從自然界中分離出來的［6］。該觀點主要體現(xiàn)在從人的肝臟組織中分離出來的AAV9 上，AAV9是F 血清型分支，具有繞過血腦屏障（blood brain barrier，BBB）轉導至中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的能力。如最近備受關注的人類衍生的F 衣殼分支是從CD34+人類外周血造血干細胞中分離出來的，顯示出無核酸酶基因編輯的能力［7］。

2.1.1.2 合理設計 改造載體衣殼的主要途徑是合理設計，這種策略始于多肽（與細胞特異性受體結合的多肽序列）序列的簡單拼接［8］。其他方法是將多肽序列融合至VP2 的氨基末端［9］，如單鏈可變片段［10］和設計的錨蛋白重復序列［11］，對細胞表面進行標記類似于抗體識別。此外，普遍認為3 倍突起在衣殼的靶向性和免疫原性方面起重要作用，因此，3 倍突起的暴露位置是多肽插入（增強受體結合）的理想位置。該方法不僅可重新定向衣殼，而且具有抑制免疫反應的能力。雖然對衣殼結構進行合理的改造可改善其靶向性，但也會對衣殼的穩(wěn)定性等其他特性產生負面影響。而點擊化學的引入可對病毒粒子組裝后的衣殼進行修飾，通過點擊化學氨基酸的方法可使寡核苷酸位點特異性地偶聯(lián)到AAV 衣殼表面，從而有效地保護AAV 顆粒不受中和抗體的吞噬［12］。

2.1.1.3 定向改造 合理設計方法的局限性是對AAV 細胞表面結合、內化、轉運、脫殼和基因表達的認識不足。新方法即定向改造更有優(yōu)勢。定向改造的基礎在于對自然進化的模擬，衣殼在自然選擇壓力下產生具有特定生物學特性的遺傳變異（如組織特異性、免疫逃逸和轉基因表達）［6］。衣殼文庫的定向進化不需要事先了解改造過程中所涉及的分子機制［13］。如通過3 倍突起處嵌入多肽序列文庫進行反復的體外篩選，獲得了具有顯著重定向取向的衣殼［14］。許多研究也利用該方法從已存在的主要血清型序列中隨機產生了嵌合衣殼（衣殼重組）［16］。值得注意的是最近開發(fā)的rAAV 載體，其可優(yōu)先靶向HIV-1 感染的H9 T 細胞系［16］。其中較顯著的定向改造方法是基于Cre 重組的改造［14］。該方法采用在3 倍突起的位置插入隨機多肽片段，依靠Cre 重組酶來修復設計到載體基因組中的反向聚腺苷酸序列。利用該方法進化出的衣殼突變體能夠繞過血腦屏障高效轉導至中樞神經(jīng)系統(tǒng)［17］。

2.1.1.4 計算機生物信息學 使用計算機工具大大提高了載體的設計方法，該方法不需要完全理解AAV 衣殼的生物學特性。近年來，運用計算機生物信息學改造新型衣殼的方法受到廣泛關注。利用該技術發(fā)現(xiàn)了載體Anc80L65，在小鼠肝臟、骨骼肌、視網(wǎng)膜和耳蝸中具有很好的轉導療效［18］。最新的研究表明，人工合成的AAV2.7m8 載體感染外耳毛細胞的效率高于Anc80L65［19］。

2.1.2 rAAV 載體構建的設計

典型的rAAV 載體的設計通常均攜帶1 個基因表達盒，其中包括1 個啟動子、1 個轉基因和1個轉錄終止信號。一旦載體被傳遞到靶細胞核，這些成分就相互作用表達具有治療水平的基因產物?；虮磉_盒的設計應滿足治療基因的要求（如轉基因表達水平，包裝容量）。在設計rAAV 載體時，應考慮衣殼與基因組之間的協(xié)同作用，最終需設計出一種衣殼和載體基因組的最優(yōu)組合，以達到成功治療人類疾病的目的。

2.1.2.1 調控轉基因表達水平和特異性 rAAV 基因治療平臺通常利用1 個強啟動子來實現(xiàn)轉基因的高表達，其中包括巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）啟動子和CB7 啟動子［20］，以及其他一些可增強基因表達的調控元件，如內含子［21］和土撥鼠肝炎轉錄后調控元件（woodchuck hepatitis post-transcriptional regulation element，WPRE）［22］。在人類細胞中，為了產生穩(wěn)定的蛋白表達，密碼子優(yōu)化技術被廣泛應用于rAAV 基因治療，旨在提高rAAV 基因的表達水平［23-24］。在翻譯水平上，Kozak 序列可進一步增加蛋白表達［23］。但蛋白質或RNA 分子的過表達可能對細胞的生長產生一定的毒性，如由強U6 啟動子驅動的shRNA 與內源性microRNA（miRNA）的過表達導致小鼠死亡，可通過使用較弱的H1 啟動子來改善［25］。另外，基于PolⅡ啟動子的人工micro-RNAs（amiRs）表達新平臺為平衡蛋白的表達提供了一種更為通用的解決策略［26-27］。表達特異性是基因治療的另一個重要方面。在異常組織或細胞中的基因表達可能導致細胞毒性或引發(fā)不必要的免疫反應。從rAAV 載體基因組設計的角度來看，更好地限制基因表達的方法包括使用組織或細胞特異性啟動子［28］，以及在3′未翻譯區(qū)域（UTR）整合miRNA結合位點，以達到調控轉基因表達的目的［29］。

2.1.2.2 對較大轉基因所采取的策略 與其他病毒載體相比，AAV 載體的局限性是其包裝容量較小（5 000 bp 包括ITRs）。目前已研究出幾種策略可轉導較大的治療基因。研究表明，采用AAV 雙載體的方法（rAAV、反式剪接以及雜合［30-31］）可將AAV 的包裝容量增加至10 000 bp，triple AAV 載體的設計可轉導14 000 bp 的DNA［32］。且已通過實驗證明，雙AAV 載體系統(tǒng)向哺乳動物內茸毛細胞（inner hair cell，IHC）傳遞otoferlipn 大型轉基因，可部分恢復聽覺功能［22］。利用反式剪接和雜交的triple AAV 載體，在視網(wǎng)膜中表達了全長CDH23 和ALMS1［33］。雜交AAV 載體已成功用于移植大型治療基因，包括ABCA4［34］、RPE65［35］、ABCA4［36］和dysferlin［37］，利用該策略相較于其他方法有更好的臨床應用機會。除此之外，還有研究采用設計1 個縮短版的基因，來編碼1 個被截短但有功能的蛋白質的策略。人類抗營養(yǎng)不良蛋白（duchenne muscular dystrophy，DMD）基因的整個編碼序列為11 500 bp，遠超過了rAAV 的包裝極限。對DMD 蛋白的結構與功能進行分析，發(fā)現(xiàn)其可產生幾種更小的形式，再用rAAV進行包裝［38］。開發(fā)適合rAAV 傳遞的微基因可能需要深入了解蛋白質的結構和功能，具有基因特異性。針對DMD 的微基因療法仍在進行廣泛的臨床評估［38］。

2.1.2.3 延長轉基因表達所采取的策略 盡管rAAV是基因治療的理想載體，但其主要以非復制型游離基因組形式存在。因此，轉導的載體基因組在有絲分裂細胞中逐漸丟失。近年來，一直在尋找復制細胞中保留轉基因表達的方法。延長復制型細胞中轉基因表達最直接的方法是促進rAAV 基因組整合。rAAV 基因組被發(fā)現(xiàn)以低頻率整合［12］。這種罕見的整合事件通常導致部分基因組整合，因此不適用于基因治療?；蚓庉嬁赏ㄟ^針對性地對基因組進行整合來增強其持久性。一旦可編程核酸酶在靶基因組位點中引入DNA 斷裂，宿主細胞的同源性定向修復（homology-directed repair，HDR）功能即可利用rAAV 基因組作為供體模板，將治療性基因盒精確地插入宿主基因組中［39］。此外，無核酸酶的同源重組定向整合作為基因編輯的替代方法最近也受到廣泛關注［6，40］。通過這種方式，無需通過核酸酶引入DNA 斷裂即可實現(xiàn)序列的穩(wěn)定整合。另外，還有研究將支架／ 基質附著區(qū)（S ／ MAR）序列插入到構建體中，使游離形式的AAV 在轉導細胞中復制，從而延長載體存在的持久性［41］。

2.2 rAAV 載體的轉染與包裝 rAAV 載體設計成功后，需通過轉染進入宿主細胞進行復制。傳統(tǒng)的轉染方法采用雙質粒共轉染：將一種含有rAAV 載體及一種含有rep ／ cap 基因的質粒共轉染HEK293、A549 或HeLa 細胞，再感染輔助病毒［42］。由于該方法會有輔助病毒的污染，目前通常采用3 質粒共轉染法：1 個含有包裝信號和目的基因的病毒載體質粒、1 個含有腺病毒輔助基因形成的輔助質粒及由結構基因cap 和非結構基因rep 組成的質粒，將這3 個質粒共轉染穩(wěn)定表達E1a、E1b 輔助病毒基因的包裝細胞系HEK293，就即可產生具有感染活性的rAAV。

在rAAV 的包裝過程中，多采用多質粒共轉染法，最常用的宿主細胞是HEK293 細胞［22，33，43］。細胞基因組內不含E1a 和E1b 的HeLa 細胞及A549細胞是制備高穩(wěn)定和高生產率常用的細胞系，主要缺點是有輔助病毒污染。幼地鼠腎細胞（BHK）也可被用于生產rAAV 的宿主細胞，但由于該細胞是非人源性細胞的特性，限制了其應用范圍，目前僅應用于HSV 雜合病毒的生產［44］。草地貪夜蛾（SF9）細胞用于rAAV 的生產是近年的研究熱點［45］，目前最大的生產系統(tǒng)是利用SF9 作為宿主細胞的rAAV 生產系統(tǒng)。

2.3 rAAV 載體的純化 rAAV 的分離純化方法主要包括梯度離心和色譜技術。rAAV 的梯度離心純化較常用的是氯化銫（CsCl）密度梯度離心法［33］和碘克沙醇［22］。色譜技術包括親和色譜層析、離子交換色譜。親和色譜基于rAAV 衣殼與色譜基質上耦合特異的生物配體或受體進行可逆作用，將病毒顆粒與雜蛋白、DNA 分離，優(yōu)點是結合容量大、分辨率高、回收率高，缺點是特異性強，不適用于每一種血清型rAAV［42］。為了解決此問題，相關研究人員利用DNA 重組技術對病毒衣殼蛋白進行修飾，再利用親和層析進行分離純化。親和色譜層析不能區(qū)分空心病毒顆粒和實心rAAV 載體，空心病毒在包裝單鏈DNA 后等電點降低，可通過高分辨率的離子交換方法與rAAV 載體分離［46］。

3 rAAV 載體在臨床基因治療中的應用

自1983 年首次開發(fā)rAAV 載體以來，在基因治療方面已取得了很大進展，主要體現(xiàn)在兩方面：rAAV載體種類（新型載體的發(fā)現(xiàn)和現(xiàn)有載體的改造）和臨床治療疾病種類擴展（由遺傳性疾病到基因缺陷病）。首先，AAV 的載體類型由單一的rAAV2 擴展到rAAV1、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9等，并出現(xiàn)了一批有顯著治療效果的AAV 載體；其次，在臨床實驗上，治療疾病的種類有很大發(fā)展，從最初的針對于單基因遺傳?。廴绶文倚岳w維化（cystic pulmonary fibrosis，CPF）和血友病B 等］，發(fā)展到眼部疾病、關節(jié)炎、腫瘤、肌營養(yǎng)不良癥、神經(jīng)性疾病以及血液性疾病等一系列基因缺陷病，見表3。

表3 AAV 載體基因治療藥物的臨床試驗Tab.3 Clinical trials of adenoviral vectors as drugs for gene therapy

3.1 眼部方面的疾病 對于眼部疾病早先是利用腺病毒載體進行治療，如PING 等［47］利用高容量的腺病毒載體治療年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）。近年來，由于rAAV 載體的優(yōu)勢，出現(xiàn)了多項以rAAV 為基因治療載體治療視網(wǎng)膜色素變性、萊伯氏先天性黑蒙以及缺血性視網(wǎng)膜疾病的臨床試驗。其中，rAAV 介導的RPE65基因治療萊伯氏先天性黑蒙于2018 年1 月獲得FDA 批準。這是美國第一個針對單一基因突變疾病的臨床基因治療藥物。在臨床研究上發(fā)現(xiàn)，由rAAV介導的基因治療藥物未引起嚴重的免疫反應，也未出現(xiàn)明顯的毒副作用，并對患者的視力恢復起到了一定的作用［48］。這些研究表明，rAAV 載體是基因治療中最有前景的基因轉移載體，目前國內外關于rAAV 應用于眼部治療的研究已在多方面開展，相信經(jīng)過進一步的深入研究，利用rAAV 進行眼部治療將會有更多的突破。

3.2 聽覺神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病 在聽覺神經(jīng)系統(tǒng)的基因治療研究中，較常用的AAV 載體包括AAV2、AAV1、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、Anc80L65［49-52］。雖然在人類內耳基因治療中尚無臨床實驗數(shù)據(jù)，但臨床前動物研究已表明，以rAAV 作為基因治療載體是有效的。如SUZUKI 等［52］的一項研究表明，利用Anc80L65 載體可提高毛細胞存活率，有效恢復耳蝸聽覺皮層神經(jīng)反應和前庭刺激行為反應。截至目前，僅有一項正在進行的人類臨床實驗旨在研究人類內耳細胞中rAAV 的病毒轉導效率［53］（https：／ ／clinicaltrials.gov ／ ct2 ／ show ／ NCT03996824）。

rAAV 介導的基因藥物除了用于治療上述疾病外，還應用于其他多種基因缺陷性疾病的治療，包括血液系統(tǒng)疾?。ㄑ巡。?、腫瘤、皮膚與肌肉系統(tǒng)疾病（肌營養(yǎng)不良癥）、關節(jié)炎、糖尿病等。

4 AAV 可能引起的不良反應

AAV 在進行動物和人類臨床實驗時，可能會引起不良反應。首先是免疫反應，當rAAV 感染抗原呈遞細胞時，由于Toll 樣受體9（Toll like receptor 9，TLR9）的激活，可引起溫和的先天免疫反應，TLR9識別核酸中未甲基化的CpG，從而激活經(jīng)典通路和非經(jīng)典NF-κB 通路，促使炎細胞因子和干擾素應答基因的表達。這些基因的表達反過來會產生CTL反應和穩(wěn)定的中和抗體效價［4］。為避免AAV 介導的基因轉移所引起的免疫反應，目前常用的方法有以下兩種：①用免疫抑制藥物，以避免CTL 反應，這在人類因子Ⅸ試驗中取獲得了成功［54］；②在設計rAAV 載體時，加入TLR9 抑制的DNA 序列，如將來自人類端粒的TTAGGG 的多拷貝整合至rAAV 基因組中，以逃避先天免疫反應［1］。

第2 種不良反應是可能會引起插入誘變和誘導癌癥。NGUYEN 等［55］利用AAV 基因療法治療狗的血友病A 時發(fā)現(xiàn)，AAV 攜帶的治療性基因片段（FⅧ）已整合至狗肝臟細胞的基因組，有些甚至整合在影響細胞生長的基因附近，這些狗的某些肝臟細胞分裂得比其他細胞更快，并形成子細胞團塊。因此，他們懷疑這些基因插入物激活了生長相關基因，使得這些肝臟細胞更為快速地分裂。這一發(fā)現(xiàn)證實了AAV 基因療法會將基因片段整合至宿主細胞染色體上，雖然整合頻率不高，但仍有潛在致癌性，可能誘發(fā)癌癥。

第3 種不良反應是靜脈高劑量注射AAV 會產生嚴重毒性。HINDERER 等［56］研究發(fā)現(xiàn)，高劑量AAV 注射后，在恒河猴和仔豬中均引起了嚴重的毒性。3 只恒河猴出現(xiàn)明顯的轉氨酶升高。2 只轉氨酶升高后消退，無臨床后遺癥，而有1 只發(fā)生急性肝衰竭和休克。

5 展 望

雖然rAAV 載體在人類基因治療過程中取得了一些成果，但rAAV 最終應用于臨床治療尚有一些亟待解決的問題。首先，目前rAAV 載體存在兩個缺陷：載體容量小和輔助基因污染，針對這些問題，若能開發(fā)出大容量，且能用于擴大生產和應用于臨床的rAAV 載體，篩選出包裝rAAV 所需的所有輔助基因均由包裝的細胞來提供的細胞系，可避免輔助基因的污染；其次，隨著AAV 血清型的多樣性和新型AAV 載體的不斷開發(fā)，將帶來其安全性問題；最后，rAAV 的大規(guī)模生產、純化能否達到臨床治療所需的劑量也是將來載體應用中需要考慮的問題。相信后續(xù)隨著rAAV 載體研究的不斷深入，作為基因治療最常用的載體之一，其應用前景將更加廣闊。