黃慧麗 綜述，吳佳靜，梁春南 審校

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629

2020 年，新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）疫情肆虐全球［1-2］，確診病例和死亡人數(shù)持續(xù)增加，該病傳播能力強(qiáng)、危險(xiǎn)系數(shù)高、防控難度大。國(guó)際病毒分類委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）將造成本次疫情的病毒命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）［3］。2020 年12 月14 日，英國(guó)向WHO 報(bào)告了一種病毒變體D614G［4］，傳播能力比普通的SARSCoV-2 高70%，加劇了疫情發(fā)展的不確定性，同時(shí)增加了疫苗研發(fā)的困難［5-7］。截至2021 年2 月，全球累計(jì)確診病例超1.1 億，累計(jì)死亡病例已超253 萬(wàn)，對(duì)人類社會(huì)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響［8-11］。

SARS-Cov-2 在分類學(xué)上屬于冠狀病毒科和Sarbecovirus 病毒亞屬［3］，是一種有包膜、單股正鏈RNA病毒，基因序列長(zhǎng)度約為30 000 bp，主要由核衣殼蛋白、包膜蛋白、刺突表面糖蛋白和基質(zhì)蛋白等相關(guān)蛋白組成［5］。SARS-Cov-2 主要通過(guò)呼吸道飛沫和人體密切接觸傳播［12］，人感染后一般會(huì)有數(shù)天無(wú)癥狀潛伏期［13］，后續(xù)可出現(xiàn)乏力、干咳、發(fā)熱等癥狀，易判別；另有一些病例長(zhǎng)期無(wú)癥狀但攜帶病毒［14］，增加了診斷的困難，不利于疫情的控制。因此，針對(duì)正常人群、疑似病例、無(wú)癥狀感染者進(jìn)行快速、準(zhǔn)確診斷與篩查是COVID-19 防控工作中最初和最重要的環(huán)節(jié)［15-16］。本文主要就應(yīng)用于COVID-19 診斷的核酸檢測(cè)法、抗體檢測(cè)法及抗原檢測(cè)法的研究進(jìn)展作一綜述。

1 核酸檢測(cè)法

病毒RNA 序列是區(qū)分病毒與其他病原體的特異性標(biāo)志物，因此病毒RNA 檢測(cè)是COVID-19 前期診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。目前，SARS-CoV-2 檢測(cè)的核酸片段主要有ORF1ab 基因、N 基因、E 基因、S 基因等［17-18］。檢測(cè)方法主要包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（quantitative real time PCR，RT-PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)、成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）基因組編輯技術(shù)、數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）技術(shù)、全基因組測(cè)序等。

1.1 RT-PCR 法 該方法是利用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA片段反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)的單鏈DNA 序列，在特定引物的作用下，將其經(jīng)PCR 反應(yīng)擴(kuò)增獲得雙鏈DNA，利用信號(hào)基團(tuán)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因檢測(cè)［19］。COVID-19 診療方案（試行第八版）規(guī)定，疑似病例經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性者即為COVID-19 確診病例［20］。RT-PCR 法靈敏度高、特異性好、快速、方便且成本低，是目前COVID-19最常用的診斷技術(shù)，其關(guān)鍵點(diǎn)是特異性引物的設(shè)計(jì)［21］。YüCE 等［16］對(duì)用于檢測(cè)SARS-CoV-2 相關(guān)基因的引物序列進(jìn)行了總結(jié)，這些引物組成不同，檢測(cè)的靈敏度及特異性也較高。JUNG 等［22］對(duì)不同引物對(duì)應(yīng)的檢測(cè)能力進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，檢測(cè)N 基因及ORF1基因的最靈敏引物分別為2019-nCoV N2 與N3（美國(guó)）及ORF1ab（中國(guó)）。NALLA 等［23］通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CORMAN 等［24］針對(duì)E 基因檢測(cè)設(shè)計(jì)的引物序列具有高靈敏性和特異性。

目前，已有多種RT-PCR 試劑盒獲批，但準(zhǔn)確率尚有待提高。SHEN 等［25］采用4 種國(guó)內(nèi)已通過(guò)審批的試劑盒對(duì)142 份COVID-19 患者鼻咽拭子樣本進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為80% ~ 92%；對(duì)82 份COVID-19 患者痰液樣本進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為82% ~ 94%。GARG等［26］采用7 種國(guó)外的RT-PCR 試劑盒分別檢測(cè)了40 個(gè)陽(yáng)性樣本，僅有4 個(gè)品牌的試劑盒檢測(cè)的陽(yáng)性率為100%，其他3 個(gè)試劑盒陽(yáng)性檢測(cè)率分別為90%、85%和75%。為提高試劑盒的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，研究者一直在開發(fā)更為高效的RT-PCR 檢測(cè)方法，如endpoint RT-PCR［27］、multiplex real-time RT-PCR［28］和droplet digital RT-PCR［29］等。

目前，RT-PCR 檢測(cè)在疫情防控中發(fā)揮了重要作用，是疑似病例排除和接觸者解除隔離的主要判斷依據(jù)［30］。由于SARS-CoV-2 為RNA 病毒，RNA 易降解，因此采集樣本時(shí)需使用無(wú)RNA 酶的拭子和儲(chǔ)存管。另外，該檢測(cè)方法需要分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)的儀器及操作人員，操作不當(dāng)或?qū)嶒?yàn)室條件不足均可能會(huì)由于氣溶膠污染而造成假陽(yáng)性。

1.2 LAMP 方法 該方法是利用靶基因的特異性引物及鏈置換DNA 聚合酶，在恒溫條件下反應(yīng)30 ~60 min，即可實(shí)現(xiàn)核酸109~1010倍的擴(kuò)增。LAMP 方法不需要模板的高溫?zé)嶙冃浴囟妊h(huán)等過(guò)程，更加快速、簡(jiǎn)單，在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等指標(biāo)上相當(dāng)甚至優(yōu)于RT-PCR 法。目前，已有LAMP 檢測(cè)試劑盒獲批，如由博奧生物集團(tuán)有限公司聯(lián)合清華大學(xué)、四川大學(xué)華西醫(yī)院共同設(shè)計(jì)開發(fā)的用于6 項(xiàng)呼吸道病毒恒溫?cái)U(kuò)增芯片試劑盒，能夠特異性檢測(cè)SARS-CoV-2，檢測(cè)時(shí)間只需1.5 h。YU 等［31］設(shè)計(jì)靶向性擴(kuò)增ORF1ab 基因引物，建立了RT-LAMP 檢測(cè)SARS-CoV-2 的方法，檢測(cè)時(shí)間僅為15 ~ 40 min，對(duì)248 份COVID-19 患者樣本陽(yáng)性檢出率為89.9%（223／248），與RT-PCR 的檢出效率基本一致，表明該方法具有良好的可靠性及應(yīng)用潛能。THI 等［32］設(shè)計(jì)了一組針對(duì)N 基因的引物，并開發(fā)了一種雙色LAMP 檢測(cè)方法，檢測(cè)768 份COVID-19 患者咽拭子樣本，表現(xiàn)出較高的靈敏度與特異性，分別為97.5%與99.7%。LAMP 方法中的引物設(shè)計(jì)相比于RT-PCR 要求要高，增加了應(yīng)用難度；另外，LAMP 高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)有時(shí)反而限制了其應(yīng)用，即易產(chǎn)生氣溶膠污染造成假陽(yáng)性。

1.3 CRISPR 技術(shù) 向?qū)NA 能夠指導(dǎo)Cas 蛋白識(shí)別并切割帶有SARS-CoV-2 特異序列的RNA分子，在整個(gè)體系中加入帶有熒光標(biāo)記的信號(hào)分子，一旦RNA 被切開，就會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)。利用該特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-CoV-2 的特異性、高靈敏度檢測(cè)［33］。BROUGHTON 等［34］報(bào)道了一種基于CRISPR-Cas12系統(tǒng)檢測(cè)SARS-CoV-2 的試紙條方法，僅需40 min 即可完成檢測(cè)，通過(guò)對(duì)36 名COVID-19 患者和42 名其他呼吸道疾病患者的咽拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，表明試紙條具有較好的靈敏度和特異性（分別為95%及100%）。ZHANG 等［35］開發(fā)了一種基于CRISPR-SHERLOCK系統(tǒng)檢測(cè)SARS-CoV-2 的試紙條，靈敏度達(dá)到單分子級(jí)。該團(tuán)隊(duì)又利用磁珠法簡(jiǎn)化了SARS-CoV-2 RNA 富集過(guò)程，縮減至15 min，開發(fā)了一款智能手機(jī)APP 幫助檢測(cè)人員對(duì)結(jié)果進(jìn)行解讀，采用該方法檢測(cè)202 份COVID-19 陽(yáng)性患者和200 個(gè)陰性人群的鼻咽拭子樣本，靈敏度和特異性均較高，分別為93.1%及98.5%［36］。

2020 年11 月24 日，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)國(guó)內(nèi)首個(gè)利用CRISPR 技術(shù)檢測(cè)SARS-CoV-2 的試劑盒（CRISPR 免疫層析法）使用，由杭州眾測(cè)生物科技有限公司與軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院聯(lián)合研發(fā)。該產(chǎn)品結(jié)合重組酶介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的靈敏性和CRISPR 基因編輯技術(shù)的特異性，在恒溫條件下進(jìn)行核酸的擴(kuò)增及檢測(cè)，同時(shí)可在試紙條上讀取結(jié)果。目前，有多種基于CRISPR 技術(shù)的方法處于研發(fā)中，如CRISPR／Cas9 系統(tǒng)［37］、CRISPR／Cas13a 系統(tǒng)［38］、RT-LAMP-CRISPR 聯(lián)用方法［39］等。但CRISPR 系統(tǒng)研究時(shí)間較短，仍存在脫靶的可能。

1.4 數(shù)字PCR 技術(shù) 將PCR 反應(yīng)體系縮小至微滴陣列中，靈敏度可實(shí)現(xiàn)單個(gè)核酸分子的檢測(cè)，具有更高的檢測(cè)精度。TAN 等［40］對(duì)數(shù)字PCR 在COVID-19疫情與相關(guān)臨床應(yīng)用中的改進(jìn)和發(fā)展方向提出了見解，數(shù)字PCR 可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)的SARS-CoV-2 檢測(cè)，如精子、全血、尿液、糞便等。2021 年1 月1 日，光明日?qǐng)?bào)報(bào)道了國(guó)際計(jì)量局關(guān)于SARS-CoV-2 核酸測(cè)量國(guó)際比對(duì)結(jié)果，結(jié)果表明，數(shù)字PCR 法可在全世界范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-CoV-2 核酸含量的高精確測(cè)量［41］。上述結(jié)論將有助于數(shù)字PCR 技術(shù)應(yīng)用于COVID-19的診斷。

1.5 全基因組測(cè)序 利用高通量測(cè)序技術(shù)，可在第一時(shí)間獲取新發(fā)現(xiàn)未知病毒的基因組序列信息，能夠精準(zhǔn)鑒定病毒類型［42］。COVID-19 診療方案（試行第八版）規(guī)定，疑似病例病毒基因測(cè)序與已知的SARS-CoV-2 高度同源即為確診病例［20］。如2020年12 月14 日，英國(guó)通過(guò)病毒基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)一種新的SARS-CoV-2 變體［4］，傳播能力比普通的SARS-CoV-2高70%，加劇了疫情發(fā)展的不確定性。ZHOU 等［43］利用基因測(cè)序構(gòu)建進(jìn)化樹揭示SARS-CoV-2 相關(guān)特性，分析了病毒的自然宿主溯源、病毒向人傳播的途徑、病毒的致病病理機(jī)制等，并指出SARS-CoV-2在動(dòng)物中變異后對(duì)人健康的影響還需更多深入的研究。由于測(cè)序過(guò)程繁瑣、時(shí)間較長(zhǎng)、成本也較高，在常規(guī)防疫檢測(cè)中應(yīng)用較少。但該技術(shù)對(duì)病毒的鑒定、溯源、流行病學(xué)調(diào)查及疫苗研發(fā)具有重要作用。

2 抗體檢測(cè)法

SARS-CoV-2 入侵人體后，可刺激人體免疫細(xì)胞產(chǎn)生具有保護(hù)作用的免疫球蛋白，其中IgM 抗體產(chǎn)生于病毒感染后5 ～7 d，隨后消失；IgG 抗體產(chǎn)生于感染后10 ～15 d，于人體血清中存在時(shí)間較長(zhǎng)。因此通過(guò)檢測(cè)患者血液中SARS-CoV-2 特異性IgM 和IgG 抗體，有助于判斷患者所處感染的時(shí)期。尤其針對(duì)無(wú)癥狀感染者，核酸聯(lián)用抗體檢測(cè)有利于對(duì)人群進(jìn)行分層管理：若IgG 呈陽(yáng)性但I(xiàn)gM 呈陰性，表明受檢者曾感染過(guò)病毒但已產(chǎn)生抗體，不再需要隔離；如果兩者均呈陽(yáng)性，表明受檢者可能是已感染病毒但尚未出現(xiàn)癥狀，需要進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察與隔離。COVID-19診療方案（試行第八版）規(guī)定，新增疑似病例滿足以下一條即為確診病例：血清SARS-CoV-2 特異性IgM和IgG 抗體均呈陽(yáng)性；血清SARS-CoV-2 特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性或恢復(fù)期較急性期高4 倍及4倍以上［20］。目前抗體檢測(cè)方法主要有試紙條方法、化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法等。

2.1 試紙條法 試紙條法操作簡(jiǎn)便，其試劑盒易于商品化，適用于大規(guī)模人群的篩查［44-45］。常見檢測(cè)信號(hào)包括熒光和膠體金兩種，前者可通過(guò)簡(jiǎn)單的手持儀器照射顯示結(jié)果，靈敏度較高；后者可實(shí)現(xiàn)肉眼觀察結(jié)果，方便實(shí)用。目前常用的為膠體金顯色，如國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的浙江東方基因生物制品股份有限公司研發(fā)的膠體金檢測(cè)試劑盒，可在15 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)人全血、血清或血漿中的IgG 和IgM抗體檢測(cè)。但該方法存在靈敏度低、無(wú)法定量、有暴露風(fēng)險(xiǎn)等局限。目前，一些高靈敏度的技術(shù)應(yīng)用于試紙條，如以納米銀球?yàn)榛A(chǔ)的試紙條，量子點(diǎn)熒光試紙條等。

2.2 化學(xué)發(fā)光法 該方法的原理是將SARS-CoV-2抗原蛋白包被在微粒上，抗原蛋白結(jié)合COVID-19患者血清中的IgG ／ IgM，隨后加入化學(xué)標(biāo)記的人IgG ／ IgM 二抗，經(jīng)過(guò)清洗去除游離態(tài)的化學(xué)標(biāo)記物后再加入發(fā)光底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，通過(guò)測(cè)量光信號(hào)完成對(duì)血清中IgG ／ IgM 的定性或定量檢測(cè)［46］。目前獲得審批產(chǎn)品中應(yīng)用的化學(xué)發(fā)光法分為4 類：酶促化學(xué)發(fā)光法（如天津博奧賽斯生物科技股份有限公司的IgG 與IgM 檢測(cè)試劑盒）、直接化學(xué)發(fā)光法（如邁克生物股份有限公司IgG 與IgM 檢測(cè)試劑盒）、微?；瘜W(xué)發(fā)光法（如深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司的IgG 與IgM 磁微粒檢測(cè)試劑盒，廈門萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司的化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法）、上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析法（如北京熱景生物技術(shù)有限公司的抗體檢測(cè)試劑盒）?；瘜W(xué)發(fā)光法是一種比較先進(jìn)的免疫檢測(cè)技術(shù)，能夠達(dá)到定量檢測(cè)的目的，具有自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、方法穩(wěn)定及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但儀器及試劑成本較高，大規(guī)模篩查有難度。

2.3 ELISA 法 該方法是抗原抗體反應(yīng)與酶科學(xué)相互結(jié)合的一種常見免疫分析方法，標(biāo)本中的抗體（抗原）與固相載體表面的抗原（抗體）發(fā)生特異性反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，加入酶標(biāo)記的抗原或抗體后也在固相載體表面發(fā)生復(fù)合，由于固相載體中受標(biāo)檢測(cè)物與酶的量呈一定的比列關(guān)系，通過(guò)酶催化底物顏色的變化進(jìn)行定性或定量分析，從而達(dá)到檢測(cè)的目的［47］。目前用于SARS-CoV-2 檢測(cè)的ELISA 法基本有3 種：①雙抗原夾心法檢測(cè)患者血清中的總抗，使用的抗原蛋白是SARS-CoV-2 S 蛋白的RBD；②捕獲法檢測(cè)患者血清中的IgM，使用的抗原蛋白是HRP 標(biāo)記的RBD；③間接法檢測(cè)患者血清中的IgG，使用的抗原蛋白是SARS-CoV-2 N 蛋白。

ELISA 法對(duì)設(shè)備要求低、檢測(cè)靈敏度高，操作方法簡(jiǎn)便，特異性較強(qiáng)，且檢測(cè)成本低，但由于操作步驟多，耗時(shí)較長(zhǎng)，通常只能進(jìn)行定性或半定量檢測(cè)，該技術(shù)比較適合基層的檢測(cè)機(jī)構(gòu)用于大規(guī)模篩查。該方法可能會(huì)由于標(biāo)本中存在干擾物質(zhì)（如類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體、補(bǔ)體、溶菌酶等）、標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本凝固不全殘留有纖維蛋白原等因素影響而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

3 抗原檢測(cè)法

SARS-CoV-2 的結(jié)構(gòu)蛋白是其特異性的標(biāo)志物，也是刺激患者產(chǎn)生特異性抗體的抗原。在SARSCoV-2 組成中，蛋白含量遠(yuǎn)大于RNA 核酸，因此檢測(cè)抗原也是檢測(cè)SARS-CoV-2 的一種途徑［48-49］。但病毒表面抗原蛋白易產(chǎn)生變異，給抗原檢測(cè)帶來(lái)了一定的困難?？乖瓩z測(cè)步驟總體與抗體方法一致。目前，已有少數(shù)的抗原檢測(cè)試劑盒獲得審批，如廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的SARS-CoV-2 抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法），產(chǎn)品檢測(cè)耗時(shí)為20 min以內(nèi)，在急性感染期病毒載量較高時(shí)能夠快速檢出陽(yáng)性病例，可用于對(duì)疑似病例進(jìn)行早期分流和快速管理；深圳華大因源醫(yī)藥科技有限公司研發(fā)的抗原熒光檢測(cè)試紙條，操作十分簡(jiǎn)單，非專業(yè)人員也可以輕松掌握。

目前，抗原檢測(cè)法作為現(xiàn)有檢測(cè)方法的補(bǔ)充，不能單獨(dú)用于SARS-CoV-2 感染的診斷，結(jié)果應(yīng)結(jié)合核酸檢測(cè)、影像學(xué)等其他診斷信息及病史、接觸史判斷感染狀態(tài)。疑似人群抗原陽(yáng)性及陰性結(jié)果均應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的核酸檢測(cè)。隨著SARS-CoV-2 滅活疫苗的廣泛接種，血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)用于診斷效力下降，而抗原指標(biāo)是直接與病毒感染相關(guān)的指標(biāo)，可與核酸檢測(cè)互補(bǔ)，以發(fā)揮更大的診斷價(jià)值［50-51］。

4 小 結(jié)

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局在“早期介入、隨到隨審、科學(xué)審批”的指導(dǎo)原則下，2020 年已批準(zhǔn)50 多個(gè)COVID-19 診斷試劑上市，累計(jì)日產(chǎn)能達(dá)2 400 萬(wàn)人份，基本可滿足檢測(cè)需求。目前，國(guó)內(nèi)形勢(shì)已基本穩(wěn)定，但仍有零星病例不斷出現(xiàn)。另外，國(guó)際疫情局勢(shì)仍較嚴(yán)峻，為防止病例境外輸入傳播，入境卡口可采用多次結(jié)合多種方法進(jìn)行檢測(cè)，有效阻止病毒傳播。我國(guó)大部分人群已接種COVID-19 疫苗，因此也要求抗體檢測(cè)產(chǎn)品能夠區(qū)別疫苗抗體和實(shí)際感染誘導(dǎo)的抗體。不同原理的檢測(cè)方法具有各自的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合使用可互補(bǔ)其缺點(diǎn)，提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，確保盡早篩查COVID-19 患者，及時(shí)進(jìn)行隔離及治療，有效防止疫情擴(kuò)散。