龔志遠(yuǎn)，張夢(mèng)瑤，金宏麗，黃培，張海麗，李媛媛，王化磊

吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062

產(chǎn)腸毒素型大腸埃希菌（enterotoxigenic Escheri- chia coli，ETEC）是引起仔豬腹瀉最常見(jiàn)的致病菌之一，常存在于人類、溫血?jiǎng)游锏鹊奈改c道中［1］。根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，豬疫病中腹瀉發(fā)病率高達(dá)42.49%，由腹瀉導(dǎo)致豬死淘率高達(dá)29%［2］。其中，由ETEC引起的斷奶或初生仔豬腹瀉發(fā)病率和死亡率較高，對(duì)仔豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3］。此外，ETEC 還是引起嬰幼兒腹瀉的一種重要的人獸共患病原菌。

研究發(fā)現(xiàn)，ETEC 分泌的大腸埃希菌不耐熱腸毒素（Escherichia coli heat-labile enterotoxin，LT）主要由A 亞基和B 亞基組成，根據(jù)其B 亞基氨基酸序列的差異將LT 分為Ⅰ型、Ⅱ型［4］，LT-Ⅰ型是重要的毒性來(lái)源，而LT-Ⅱ型不具備腸毒素活性，不會(huì)引發(fā)動(dòng)物疾病。LT-ⅠA 亞基（LTA）相對(duì)分子質(zhì)量約為28 000，是主要的毒性中心，該蛋白通過(guò)增加腸細(xì)胞中環(huán)腺苷酸的濃度來(lái)激活腺苷酸環(huán)化酶，并誘導(dǎo)脫水［5］。LT-ⅠB 亞基（LTB）是相對(duì)分子質(zhì)量約為60 000 的五聚體，本身無(wú)毒性，其與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1 受體結(jié)合后可介導(dǎo)LTA 進(jìn)入腸細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致仔豬腹瀉。LTB 還可促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的增殖、發(fā)育，從而增強(qiáng)其抗原提呈能力［5-7］，被證實(shí)為一種重要的黏膜免疫佐劑［8-10］。由于LT 是ETEC 的主要毒力因子之一，LTB含有其主要抗原位點(diǎn)［11］，研究LTB 致病機(jī)理和免疫原性對(duì)預(yù)防和控制大腸埃希菌引起的腹瀉性疾病具有重要意義。

本研究利用大腸埃希菌原核表達(dá)LTB 蛋白，并制備其兔源多克隆抗體，以期為ETEC 疾病的診斷及LTB 黏膜免疫佐劑特性的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及細(xì)胞 原核表達(dá)載體pET30a（+）、真核表達(dá)載體pCAGGS-GST、293T 細(xì)胞和NA 細(xì)胞均由吉林大學(xué)人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室病毒病研究室構(gòu)建并保存；Stellar 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；大腸埃希菌BL21（DE3）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)大耳白家兔2 只，6 月齡，雌性，體重2 500 g，購(gòu)自長(zhǎng)春市盛隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：202100036554。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的對(duì)所購(gòu)置的大耳白家兔進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照《國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理法規(guī)》（國(guó)務(wù)院令第676 號(hào)）動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.3 主要試劑及儀器 限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒及小鼠抗His 單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；TMB 顯色液和卡那霉素均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG 和HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 為美國(guó)Bio-world 公司產(chǎn)品；T4 DNA 連接酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；His-Ni 純化柱購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 公布的LTB基因序列（FJ407053.1），應(yīng)用Primer premier 5 軟件設(shè)計(jì)LTB 序列擴(kuò)增引物，LTB-F：5′-ATTCATATGGCACCACAAAGTATCACTGAA-3′，LTB-R1：5′-ACCAGAACCACCACCAGAACCACCATTTTCCATGGAGATAGCGG-3′，LTB-R2：5′-ATACTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGATGATGACCAGAACCACCACCAGAAC-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 LTB 基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 公布的LTB基因序列（FJ407053.1），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成目的基因片段。以合成的LTB 序列為模板，分別用設(shè)計(jì)的上下游引物進(jìn)行兩步PCR，得到帶有l(wèi)inker 與8 × His 的目的片段。第1 步PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，68 ℃（LTB-F、LTB-R1）退火15 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。第2 步PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，70 ℃（LTB-F、LTB-R2）退火15 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將切膠回收的目的片段與原核表達(dá)載體pET30a（+）分別用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收目的基因片段和載體片段，用T4 DNA 連接酶16 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Stellar 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET30a（+）-LTB-8 × His。

1.7 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的重組原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3），37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落，于37 ℃，200 r ／ min 培養(yǎng)12 h 后保存菌種。用含50 μg ／ mL 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)重組菌及pET30a（+）空載體轉(zhuǎn)化菌，菌液A600為0.4 ～0.6 時(shí)，加入0.4 mmol ／ L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，收集未誘導(dǎo)重組菌、誘導(dǎo)后重組菌、未誘導(dǎo)pET30a（+）空載體、誘導(dǎo)后pET30a（+）空載體，進(jìn)行10% SDS-PAGE 鑒定。

1.8 目的蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化及表達(dá)形式的鑒定

1.8.1 IPTG 誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 將重組菌于37 ℃，200 r ／ min 培養(yǎng)3 h 左右，分別用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mmol ／ L 的IPTG 誘導(dǎo)5 h，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行10% SDS-PAGE 分析，篩選最佳IPTG 誘導(dǎo)濃度。

1.8.2 IPTG 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 將重組菌于37 ℃，200 r ／ min 培養(yǎng)3 h 左右，加入0.4 mmol ／ L IPTG，分別誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6、7、8 h，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行10%SDS-PAGE 分析，篩選最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.8.3 IPTG 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化及表達(dá)形式的鑒定將重組菌分別于16、25、30、37 ℃，用0.4 mmol ／ L IPTG 誘導(dǎo)5 h，溶菌酶進(jìn)行裂解，分別取菌液上清、裂解上清、裂解沉淀進(jìn)行10% SDS-PAGE 分析，篩選最佳誘導(dǎo)溫度，并確定目的蛋白的表達(dá)形式。

1.9 目的蛋白的純化 在最佳誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)400 mL菌液，4 ℃，9 800 × g 離心10 min，棄上清，將菌體用20 mL 平衡液（含8 mol ／ L 尿素、0.01 mol ／ L 咪唑）重懸，進(jìn)行包涵體蛋白的變性，超聲破碎至菌液澄清，將裂解后的菌液4 ℃，9 800 × g 離心10 min，收集上清，與His-Ni 柱填料4 ℃結(jié)合過(guò)夜，分別用250、500 mmol ／L 的咪唑緩沖液洗脫目的蛋白。將洗脫的目的蛋白依次用透析液1（含5 mol ／ L 尿素、5 mol ／ L咪唑）、透析液2（含2.5 mol ／ L 尿素、2 mol ／ L 咪唑）各透析8 h，進(jìn)行蛋白復(fù)性。純化后的蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE 分析，并采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 多克隆抗體的制備 將等體積的純化后重組蛋白LTB 與弗氏完全佐劑混合并乳化后，通過(guò)皮下注射方式免疫大耳白家兔，每只抗原劑量500 μg。初次免疫后每隔14 d 進(jìn)行加強(qiáng)免疫，佐劑均為弗氏不完全佐劑，共免疫5 次。末次免疫后1 周經(jīng)心臟采血，分離血清，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.11 多克隆抗體的鑒定

1.11.1 反應(yīng)性鑒定 采用Western blot 法。將LTB序列酶切連接入真核表達(dá)載體pCAGGS-GST，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-GST-LTB，與空載體pCAGGSGST 分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞，4 ℃，300 × g 離心10 min，棄上清，沉淀中加入RIPA 裂解液裂解，收取蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)印至NC 膜上。將NC 膜用含5%脫脂奶粉的PBS 溶液在室溫條件下封閉2 h；加入免疫血清（1 ∶200 稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜；1 × PBST 洗滌，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1 ∶20 000 稀釋），室溫孵育1 h；洗滌后凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.11.2 間接免疫熒光檢測(cè)（indirect immunofluore-s cence assay，IFA） 將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGSGST-LTB 與空載體pCAGGS-GST 分別轉(zhuǎn)染NA 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h 棄上清，以80%冷丙酮室溫固定30 min；PBS 洗滌3 次，加入LTB 蛋白多克隆抗體（用含1% BSA 的PBST 溶液1 ∶200 稀釋），37 ℃孵育1 h；PBST 洗滌5 次，加入FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG（1 ∶200 稀釋），37 ℃避光孵育1 h；PBST 洗滌5 次，置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 LTB 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，通過(guò)兩步PCR 擴(kuò)增得到357 bp 的目的基因片段，見(jiàn)圖1。

圖1 LTB 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of LTB gene

2.2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，重組質(zhì)粒pET30a（+）-LTB-8 × His 經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，可見(jiàn)357 bp 的目的基因條帶，見(jiàn)圖2。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a（+）-LTB-8 × His 的雙酶切（NdeⅠ／ XhoⅠ）鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pET30a（+）-LTB-8 × His（NdeⅠ／ XhoⅠ）

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 10% SDS-PAGE 分析顯示，重組質(zhì)粒誘導(dǎo)后菌液在相對(duì)分子質(zhì)量約13 000 處出現(xiàn)目的條帶，大小與預(yù)期相符，而空載體菌液未出現(xiàn)目的條帶，見(jiàn)圖3。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE profile of expressed product

2.4 目的蛋白最佳表達(dá)條件及表達(dá)形式

2.4.1 最佳IPTG 誘導(dǎo)濃度 10%SDS-PAGE 分析顯示，IPTG 濃度大于0.4 mmol ／ L 后，目的蛋白的表達(dá)量并無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖4。因此選擇0.4 mmol ／ L為最佳IPTG 誘導(dǎo)濃度。

圖4 不同濃度IPTG 誘導(dǎo)LTB 表達(dá)的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE profile of LTB expressed under induction of IPTG at various concentrations

2.4.2 最佳誘導(dǎo)時(shí)間 10% SDS-PAGE 分析顯示，0.4 mmol ／ L IPTG 誘導(dǎo)4 h 后，目的蛋白的表達(dá)量并無(wú)明顯增加，見(jiàn)圖5。因此選擇4 h 為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

圖5 不同誘導(dǎo)時(shí)間LTB 表達(dá)的SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE profile of LTB expressed after induction for various hours

2.4.3 最佳誘導(dǎo)溫度及表達(dá)形式 10% SDS-PAGE分析顯示，在30 ℃時(shí)目的蛋白的表達(dá)量最高，因此選擇30 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度；目的蛋白的表達(dá)形式為包涵體表達(dá)。見(jiàn)圖6。

圖6 不同誘導(dǎo)溫度LTB 表達(dá)及其表達(dá)形式的SDSPAGE 分析Fig.6 Analysis of expression form of LTB induced at various temperatures by SDS-PAGE

2.5 純化重組蛋白的鑒定 純化的重組蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE 分析，可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約13 000的目的蛋白條帶，見(jiàn)圖7。BCA 法測(cè)得蛋白濃度為3.7 mg ／ mL。

圖7 純化產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.7 SDS-PAGE profile of purified target protein

2.6 多克隆抗體的鑒定

2.6.1 反應(yīng)性 Western blot 分析顯示，重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-GST-LTB 轉(zhuǎn)染組在相對(duì)分子質(zhì)量約35 000 處可見(jiàn)特異性條帶，而空載體pCAGGS-GST轉(zhuǎn)染組未見(jiàn)條帶，見(jiàn)圖8。表明制備的多克隆抗體能特異性識(shí)別LTB 蛋白。

圖8 多克隆抗體的Western blot 鑒定Fig.8 Western blotting of polyclonal antibody

2.6.2 IFA IFA 檢測(cè)結(jié)果顯示，重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-GST-LTB 轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)亮綠色熒光斑點(diǎn)，而空載體pCAGGS-GST 轉(zhuǎn)染組未見(jiàn)該熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖9。表明制備的多克隆抗體能與LTB 蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖9 LTB 蛋白多克隆抗體的IFA 檢測(cè)Fig.9 IFA of polyclonal antibody against LTB

3 討 論

LTB 因其無(wú)毒性，且具有良好的免疫原性及佐劑活性，可用于ETEC 疾病的診斷和作為黏膜免疫佐劑使用［12-14］。本研究構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a（+）-LTB-8 × His，成功表達(dá)了融合蛋白LTB，并優(yōu)化了蛋白的表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)了LTB 重組蛋白的高效表達(dá)。用純化后的重組蛋白免疫大耳白家兔，得到特異性與反應(yīng)性均良好的多克隆抗體，并成功應(yīng)用于LTB 的Western blot 與IFA 檢測(cè)。

當(dāng)前LTB 主要通過(guò)人工表達(dá)系統(tǒng)制備，但重組LTB 蛋白存在表達(dá)量低、無(wú)法以天然構(gòu)象發(fā)揮作用等問(wèn)題。常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)具有可對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)加工和修飾、發(fā)酵規(guī)模大等優(yōu)點(diǎn)，但存在蛋白表達(dá)不穩(wěn)定、產(chǎn)生的副產(chǎn)物具有一定毒性或?qū)е履康牡鞍桩a(chǎn)量下降等缺點(diǎn)［15］。陳明等［16］將酵母分泌性表達(dá)載體pPIC9K-LTB 電轉(zhuǎn)化酵母菌KM71，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的重組酵母菌可分泌表達(dá)LTB，且具有免疫原性。乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)具有制備簡(jiǎn)單、無(wú)內(nèi)毒素、目的蛋白可與菌體一同服用等優(yōu)點(diǎn)，但乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)目前尚不成熟，存在外源蛋白表達(dá)效率不高等問(wèn)題［17］。付錦楠等［18］構(gòu)建了干酪乳桿菌分泌型表達(dá)重組質(zhì)粒pMG36e-UP ／ L-LTB，電轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌393，篩選獲得重組干酪乳桿菌，表達(dá)的LTB 蛋白具有免疫活性。大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)、遺傳背景清晰、操作簡(jiǎn)單、可高效表達(dá)等優(yōu)勢(shì)。在大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)中，不同的表達(dá)載體與純化標(biāo)簽在一定程度上決定了蛋白的表達(dá)形式及純化效果，因此，選取一種合適的表達(dá)載體與純化標(biāo)簽組合在蛋白表達(dá)與純化過(guò)程中顯得尤為重要。何月等［19］采用冷休克載體pCold-TF 表達(dá)LTB，結(jié)果表明，LTB 蛋白主要以可溶性形式存在于上清中，同時(shí)，通過(guò)6 × His 標(biāo)簽對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，得到純度良好的LTB 蛋白。謝婷婷等［20］構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET32a-LTB，表達(dá)的6×His-LTB 融合蛋白用Ni2+-NTA 樹(shù)脂進(jìn)行純化，純化的融合蛋白具有良好的免疫活性和佐劑活性。雷清等［21］將重組質(zhì)粒pET21b-LTB轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞，采用陽(yáng)離子交換法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，純化的LTB 蛋白具有黏膜免疫佐劑作用。本研究選取大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)將LTB 序列通過(guò)柔性肽Linker 與8 × His 標(biāo)簽相連接，并將目的基因連接至pET30a（+）表達(dá)載體，在大量表達(dá)目的蛋白的同時(shí)，將8 × His 純化標(biāo)簽充分展示在融合蛋白之外，大大增加了融合蛋白與His-Ni 柱的親和能力。同時(shí)優(yōu)化了IPTG 濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件，提高了融合蛋白的產(chǎn)量，也為其他外源蛋白表達(dá)與純化技術(shù)優(yōu)化提供了思路。

LTB亞基是大腸埃希菌LT 的重要組成部分，本身無(wú)毒性且具有良好的免疫原性［22］，因此，純化的LTB 蛋白可與多種ETEC 黏附素抗原聯(lián)合免疫，進(jìn)而為機(jī)體提供廣泛的保護(hù)力［23-24］。LTB還具有黏膜免疫佐劑活性，可作為佐劑與抗原聯(lián)合使用增強(qiáng)免疫效果［25-26］。因此，本研究制備的LTB 重組蛋白可應(yīng)用于診斷方法的建立、疫苗制備、分子佐劑研究等多方面，所制備的多克隆抗體也可應(yīng)用于Western blot、IFA、ELISA 等檢測(cè)技術(shù)，為ETEC 疾病的診斷、疫苗研究等奠定了基礎(chǔ)。