陳瓊，王珊珊，呂雪艷，周學(xué)益，韓菲，張亭，葉強(qiáng)

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川 成都 610023；3.北京民海生物科技有限公司，北京 102600

肺炎球菌是一種條件致病菌，是侵襲性肺炎球菌疾病和社區(qū)獲得性肺炎的主要病原菌，也是腦膜炎、菌血癥、急性中耳炎和鼻竇炎的常見(jiàn)病因。老人和兒童是肺炎球菌感染高危人群。2015 年，在全球估計(jì)的583 萬(wàn)5 歲以下兒童死亡病例中，約有294 000 例［不確定范圍（uncertain region，UR）：192 000 ～366 000］是由肺炎球菌感染引起的，另外，估計(jì)有23 300 例死亡（UR：15 300 ～40 700）發(fā)生在合并感染艾滋病病毒的兒童中［1］。發(fā)展中國(guó)家的疾病和死亡率高于工業(yè)化國(guó)家，大多數(shù)死亡發(fā)生在非洲和亞洲［2］；而且肺炎球菌感染也是導(dǎo)致老年人死亡的主要原因之一［3］。目前，肺炎球菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，疫苗接種作為有效、經(jīng)濟(jì)的預(yù)防方式已獲得廣泛認(rèn)同［4］。

肺炎球菌莢膜多糖不僅是重要的毒力因子，而且作為肺炎球菌多糖疫苗的活性成分，具有型特異性，目前已發(fā)現(xiàn)90 多個(gè)血清型［5-6］?；钚猿煞郑ㄇv膜多糖）含量測(cè)定是保證肺炎球菌多糖疫苗質(zhì)量有效穩(wěn)定的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前，《中國(guó)藥典》三部（2020版）23 價(jià)肺炎球菌多糖疫苗各論中規(guī)定，各型多糖含量檢測(cè)采用速率比濁法［7］，因此，研制用于該方法的莢膜多糖國(guó)家參考品尤為重要。本研究制備了19A 型肺炎球菌多糖國(guó)家參考品，以期統(tǒng)一衡量不同來(lái)源的肺炎球菌多糖疫苗，確保不同企業(yè)生產(chǎn)的疫苗肺炎球菌莢膜多糖含量一致。

1 材料與方法

1.1 候選參考品 19A 型肺炎球菌多糖候選參考品（編號(hào)：PS19A-2020）由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。于2018 年9 月，將1 批19A 型肺炎球菌培養(yǎng)上清經(jīng)收獲、殺菌、多糖粗制、多糖精制后，再進(jìn)行除菌、溶解和分裝；分裝體積約為0.6 mL ／ 瓶，濃度（精糖粉末重量）為500 ～600 μg ／ mL，分裝量約為5 000 瓶，-70 ℃保存。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)部質(zhì)控品及肺炎球菌19c因子血清 19A型肺炎球菌多糖標(biāo)準(zhǔn)品［批號(hào)：PN-PV-01Mar2016，20 μg ／（mL·型）］和內(nèi)部質(zhì)控品（批號(hào)：00118241.0000393）由Merck Sharp&Dohme Corp.，U.S.A 惠贈(zèng)；肺炎球菌19c 因子血清購(gòu)自丹麥血清研究所（Statens SerumInstitut，SSI）。

1.3 主要試劑及儀器 UDR、IMMAGE800 緩沖液、IMMAGE800 稀釋液、IMMAGE800 洗液及免疫化學(xué)分析系統(tǒng)（IMMAGE800 Immunochemistry System）均購(gòu)自美國(guó)Beckman 公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 候選參考品的質(zhì)量分析 根據(jù)《中國(guó)藥典》三部（2020 版）中23 價(jià)肺炎球菌多糖疫苗各論對(duì)候選參考品進(jìn)行質(zhì)量分析［7］；采用1H 核磁共振法對(duì)候選參考品進(jìn)行型別鑒定，并與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的19A 型肺炎球菌多糖核磁指紋特征圖譜進(jìn)行比較。

1.5 多糖含量協(xié)作標(biāo)定

確定協(xié)作標(biāo)定操作規(guī)范，選取中國(guó)食品藥品檢定研究院（編號(hào)：01）、成都生物制品研究所有限責(zé)任公司（編號(hào)：02）及北京民海生物科技有限公司（編號(hào)：03）3 家實(shí)驗(yàn)室，標(biāo)定候選參考品的多糖含量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室至少獲得5 個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)，每個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)為3 個(gè)稀釋度的均值，每個(gè)稀釋度需進(jìn)行2 次平行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)有效性前提為標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（R2）不小于0.99，且2 次平行測(cè)定值的RSD 不大于15%，內(nèi)部質(zhì)控品的19A 型多糖含量在35 ～65 μg ／ mL。最終結(jié)果為3 家實(shí)驗(yàn)室15 個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)計(jì)算均值及RSD。

1.5.1 儀器參數(shù)設(shè)置 選擇Non-Competitive Neph.模 式，Sample or Dilution Volume 21 μL，Reaction Buffer Volume 300 μL，Compartment A Volume 21 μL，Compartment B Volume 0，Gain 4，Cal Dilution 1 ∶1，反應(yīng)時(shí)間3.5 min。

1.5.2 稀釋方案 統(tǒng)一分發(fā)多糖標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)部質(zhì)控品、血清和候選參考品給3 家協(xié)作實(shí)驗(yàn)室。將10 μg ／ mL 標(biāo)準(zhǔn)品用IMMAGE800 稀釋液稀釋至4個(gè)標(biāo)定濃度（0.75、1.0、1.5 和2.0 μg ／ mL）；內(nèi)部質(zhì)控品40 倍稀釋；候選參考品稀釋方法見(jiàn)表1，選擇3 個(gè)稀釋度供檢測(cè)。

表1 候選參考品稀釋方法（μL）Tab.1 Dilution of candidate（μL）

1.6 分裝均勻性評(píng)估 隨機(jī)抽取所需進(jìn)行均勻性評(píng)估的參考品50 瓶，采用IMMAGE800 稀釋液將候選參考品稀釋至1 ∶500 供檢測(cè)。

1.7 穩(wěn)定性評(píng)估 將候選參考品分別于2 ～8 ℃放置2、4 和8 周，25 ℃放置3、7、14、21 和28 d，37 ℃放置6 h、1 d、2 d、3 d、7 d 和14 d；反復(fù)凍融3 次，以-70 ℃超低溫冰箱中保存的參考品作為對(duì)照，測(cè)定其含量，考察參考品的加速穩(wěn)定性及反復(fù)凍融穩(wěn)定性。

2 結(jié) 果

2.1 候選參考品的質(zhì)量 候選參考品的各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》三部（2020 版）的標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表2。PS19A-20201H 核磁譜圖端基質(zhì)子區(qū)各峰的化學(xué)位移與19A 型肺炎球菌多糖核磁指紋特征圖譜一致，見(jiàn)圖1。因此，候選參考品為19A 型肺炎球菌多糖。

圖1 19A 型肺炎球菌莢膜多糖600 MHz 1H NMR 端基質(zhì)子區(qū)圖譜Fig.1 600 MHz 1H NMR anomeric proton regions of serotype 19A pneumococcal capsular polysaccharide

表2 候選參考品的質(zhì)量分析結(jié)果Tab.2 Quality analysis of candidate reference

2.2 多糖含量協(xié)作標(biāo)定 3 家實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均大于99%，各濃度2 次平行測(cè)定值的RSD 均小于10%。由3 個(gè)稀釋度獲得每次獨(dú)立數(shù)據(jù)的RSD 均小于5%。3 家實(shí)驗(yàn)室獲得的15 次標(biāo)定結(jié)果的均值為565 μg ／ mL，RSD 為8.56%。內(nèi)部控制品的多糖含量均符合標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表3。

表3 各實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定結(jié)果（μg ／ mL）Tab.3 Collaborative calibration results by various laboratories（μg ／ mL）

2.3 分裝均勻性 隨機(jī)抽取的50 瓶候選參考品19A 型多糖含量在535 ～622 μg ／ mL 之間，均值為586 μg ／ mL，最高值與最低值的RSD 為10.63%，50 瓶多糖含量的RSD 為3.16%，分裝均勻性良好。

2.4 穩(wěn)定性 19A 型多糖在37 ℃下存放3 d，多糖含量從第0 天的620 μg ／ mL 下降至545 μg ／ mL，標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，STD）為9.10%；7 d 時(shí)多糖含量為404 μg／mL，STD 為29.83%。25 ℃下存放14 d，多糖含量從第0 天的620 μg／mL 下降至544 μg ／ mL，STD 為9.23%；21 d 時(shí)多糖含量為478 μg ／ mL，STD 為18.29%。表明候選參考品于2 ～8 ℃存放8周、25 ℃存放14 d、37 ℃存放3 d，穩(wěn)定性均良好。反復(fù)凍融3 次，穩(wěn)定性良好。見(jiàn)圖2。

圖2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Result of stability test

3 討 論

全球第一個(gè)23 價(jià)肺炎球菌多糖疫苗于1983 年在美國(guó)批準(zhǔn)上市［9］。2005 年，成都生物制品研究所成功研制了我國(guó)首個(gè)23 價(jià)肺炎球菌多糖疫苗［10］。莢膜多糖作為23 價(jià)肺炎球菌多糖疫苗的唯一活性成分，檢測(cè)各型多糖含量是效力試驗(yàn)的替代指標(biāo)，也是保證疫苗質(zhì)量穩(wěn)定有效的一項(xiàng)重要指標(biāo)。1983年，LEE 等［11］建立了光散射定量比濁法檢測(cè)各型多糖含量，目前各型多糖含量檢測(cè)普遍采用速率比濁法，但缺乏國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，目前我國(guó)市場(chǎng)上有4 家企業(yè)生產(chǎn)的23 價(jià)肺炎球菌多糖疫苗，均采用企業(yè)自制參考品。

本研究采用由Merck Sharp&Dohme Corp.，U.S.A惠贈(zèng)的企業(yè)自制參考品（PN-PV-01Mar2016）作為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)定19A 型肺炎球菌多糖候選參考品（成都生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)）。根據(jù)《中國(guó)藥典》三部（2020 版）各論對(duì)候選參考品進(jìn)行質(zhì)量分析，包括蛋白質(zhì)、核酸、磷、總氮、氨基己糖、甲基戊糖、分子大小以及細(xì)菌內(nèi)毒素含量，結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》三部（2020 版）標(biāo)準(zhǔn)以及國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)，核磁共振結(jié)果顯示，此候選品為19A 型肺炎球菌多糖。多糖含量協(xié)作標(biāo)定結(jié)果顯示，速率比濁法檢測(cè)多糖含量重復(fù)性好，6 個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)的多糖含量RSD均小于10%，內(nèi)部質(zhì)控品的19A 型多糖含量RSD 也均小于15%。分裝均勻性評(píng)估結(jié)果顯示，隨機(jī)抽取的50 瓶候選品19A 型多糖含量的RSD 為3.16%，表明分裝均勻性良好。穩(wěn)定性評(píng)估結(jié)果顯示，2 ～8 ℃存放8 周，25 ℃存放14 d，37 ℃存放3 d，以及反復(fù)凍融3 次，穩(wěn)定性均良好。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功制備了19A 型肺炎球菌多糖國(guó)家參考品，并通過(guò)協(xié)作標(biāo)定確定了多糖含量，可用于肺炎球菌多糖疫苗中的多糖含量檢測(cè)。