張帥，王雙，李躍，3，李國(guó)瑞，4，黃鳳蘭，4，陳永勝，，3，4

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；4.內(nèi)蒙古民族大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新培育中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000

蓖麻（Ricinus communis L.）為大戟科雙子葉草本植物，是一種油料作物［1］，其出油率為世界十大油料作物之首，蓖麻油及其衍生物可用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥治療等領(lǐng)域，部分石油產(chǎn)品也可經(jīng)蓖麻油深加工獲得，因此，蓖麻油被喻為可替代石油的“綠色能源”［2］。我國(guó)普遍推廣高稈蓖麻，但其投入人力較多，經(jīng)濟(jì)效益低，產(chǎn)量不高，導(dǎo)致蓖麻油仍以進(jìn)口為主［3］，因此，培育高產(chǎn)、適合機(jī)械化栽培的新品種成為蓖麻育種研究的新熱點(diǎn)［4-5］。

矮稈蓖麻平均高度為80 ～150 cm，所需空間小，具有節(jié)水、抗旱、抗倒伏、易于栽培、利于實(shí)現(xiàn)機(jī)械化收割等優(yōu)勢(shì)，受到蓖麻研究人員的關(guān)注。1967年，國(guó)外研究者對(duì)矮稈蓖麻性狀遺傳規(guī)律、矮化相關(guān)基因與農(nóng)藝性狀之間的關(guān)系進(jìn)行了研究［6］。國(guó)內(nèi)對(duì)矮稈蓖麻育種研究起步較晚，主要進(jìn)行矮稈蓖麻引種方面的工作［7］。我國(guó)引進(jìn)蓖麻雜交種，并在多地進(jìn)行試種，但因適應(yīng)性差，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，制種條件不成熟等問(wèn)題，無(wú)法在我國(guó)推廣種植，這已成為蓖麻產(chǎn)量增長(zhǎng)的主要制約因素［8-9］。因此，本研究嘗試發(fā)掘新的矮化相關(guān)基因，探索矮化基因功能與矮化表型間的聯(lián)系，旨在培育適合我國(guó)土壤狀況的矮稈蓖麻新品種，使蓖麻產(chǎn)量得到提高。

Dof 基因主要通過(guò)調(diào)節(jié)赤霉素合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而調(diào)控植株矮化，相關(guān)研究主要集中在水稻、擬南芥、甘蔗等植物上［10-12］，在蓖麻方面的研究較少。Dof 蛋白可與多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑相互作用［13-14］，如赤霉素（gibberellin，GA）、脫落酸等，并能對(duì)植株矮化、碳氮平衡、光響應(yīng)、花的發(fā)育、花粉敗育、種子萌發(fā)、次生代謝、保衛(wèi)細(xì)胞基因的特異性等多方面進(jìn)行調(diào)控［15-18］，由于蛋白是一種兩性物質(zhì)，獲取較為困難，表達(dá)載體和分離方法的選擇決定了蛋白能否成功純化［19-20］。

本研究通過(guò)在線軟件分析蓖麻Dof 基因全序列，發(fā)現(xiàn)在第44 ～101 個(gè)堿基之間有一鋅指保守結(jié)構(gòu)域，對(duì)該段基因進(jìn)行克隆，并命名為RcDof（44-101），原核表達(dá)RcDof（44-101）蛋白后，進(jìn)行純化，以期為篩選蛋白結(jié)晶條件，研究其在蓖麻中作用的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸埃希菌BL21（DE3）和原核表達(dá)載體pETMBP-XE 均由內(nèi)蒙古民族大學(xué)蓖麻工程中心保存；pMD-18T-RcDof 質(zhì)粒由內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 主要試劑 DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京莊盟生物技術(shù)公司；高保真酶Ex Taq、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ、DNA marker、T4 DNA 連接酶、蛋白marker 均購(gòu)自日本TaKaRa 公司；IPTG、硫酸卡那霉素（Kan）、Tris、NaCl、咪唑、SDS、PMSF 和DTT 購(gòu)自美國(guó)Amersco 公司；酵母浸粉、胰蛋白胨等購(gòu)自美國(guó)Oxide 公司；蛋白純化儀AKTA purifier 10、RESOURCETMS 1 mL 陽(yáng)離子層析柱、surdeex 2000 Index 層析柱購(gòu)自美國(guó)GE 醫(yī)療生物公司。

1.3 RcDof 基因信號(hào)肽及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 根據(jù)RcDof 基因序列（NCB：LOC8271725），利用SignalP 4.0 server（http：／ ／ wwcbs.dtu.dk ／ services ／ SignalP-4.0 ／）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，Iprscan 軟件（http：／ ／ www.ebi.ac.uk ／interpro ／ search ／ sequence）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

1.4 RcDof（44-101）基因的擴(kuò)增 應(yīng)用SnapGene 5.0.5 軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物序列：5′-CCATGGACCAATCAGAGCCTTTGAAGTGT-3′（下劃線部分為NcoⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物序列：5′-CTCGAGTCGCTTGTTTTTGCGGCCACC-3′（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度174 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以pMD-18T-RcDof質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，51.4 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收目的片段。

1.5 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切RcDof 基因片段和pETMBP-XE 載體，以T4 DNA 連接酶16 ℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌BL21（DE3），涂布于含Kan（50 μg／mL）的LB 固體平板上，37 ℃倒扣培養(yǎng)12 h。挑取單個(gè)菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)并保存菌種，提取重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒送北京Gengery 公司測(cè)序分析。

1.6 RcDof（44-101）蛋白的小量誘導(dǎo) 將含有重組質(zhì)粒且測(cè)序正確的菌株接種于4 mL 含Kan（50 μg／mL）的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液A600達(dá)0.6 ~ 0.8，保存菌種，其余菌液中加入IPTG 至終濃度為0.5 mmol ／L，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h。各取1 mL 誘導(dǎo)前（對(duì)照）和誘導(dǎo)后的菌液，離心棄上清，用50 μL SDS 加樣緩沖液懸浮菌體，沸水浴煮沸10 min 使蛋白完全變性，進(jìn)行15% SDS-PAGE 分析。

1.7 RcDof（44-101）蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá) 在50 mL搖瓶中加入25 mL 含Kan（50 μg ／ mL）的LB 培養(yǎng)基，接種保存的菌種，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。在3 L 搖瓶中加入1 L 含Kan（50 μg ／ mL）的LB 液體培養(yǎng)基，接種10 mL 大腸埃希菌過(guò)夜培養(yǎng)物，37 ℃振蕩培養(yǎng)至菌液A600達(dá)0.6 ～0.8，加入不同濃度（0.1、0.5、1.0 mmol ／L）的IPTG，分別于37 ℃誘導(dǎo)3 h 和18 ℃誘導(dǎo)15 h 后收集菌體，離心棄上清，懸浮菌體，加入1% PMSF 與1 mmol ／ LDTT，超聲破碎后再次離心，分取上清和沉淀進(jìn)行15% SDS-PAGE 分析。取未誘導(dǎo)的菌液1 mL 作為對(duì)照。

1.8 RcDof（44-101）蛋白的純化 采用親和層析法分離RcDof（44-101）蛋白，分別用0、20、60、100、200、300、500 mmol ／ L 咪唑洗脫目的蛋白。使用蛋白純化儀用20 個(gè)柱體積使溶液濃度達(dá)到完全高鹽濃度（20 mmol ／ L Tris，1 mol ／ L NaCl，pH 7.3）后，對(duì)目的蛋白進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析。將經(jīng)離子交換純化的目的蛋白進(jìn)行濃縮，再以0.5 mL ／ min 的速度，50 mmol ／ L Tris，pH 7.3 的分子篩Buffer 對(duì)目的蛋白進(jìn)行分子篩層析，UV 法測(cè)定蛋白濃度。對(duì)各步層析得到的洗脫液進(jìn)行15% SDS-PAGE 分析。

2 結(jié) 果

2.1 RcDof 基因信號(hào)肽及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 分析結(jié)果顯示，RcDof 基因無(wú)信號(hào)肽剪切序列，可直接設(shè)計(jì)引物進(jìn)行原核表達(dá)，見(jiàn)圖1；RcDof 基因在44 ～101 個(gè)堿基之間存在1 個(gè)鋅指保守結(jié)構(gòu)域，其他地方無(wú)保守域，見(jiàn)圖2。

圖1 RcDof 基因信號(hào)肽序列分析Fig.1 Sequence analysis of signal peptide of RcDof gene

圖2 RcDof 基因保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Analysis of conserved domain of RcDof gene

2.2 RcDof（44-101）基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 RcDof（44-101）基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)174 bp 的單一條帶，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖3。

圖3 RcDof（44-101）基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoretic profile of PCR product of RcDof（44-101）gene

2.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 pETMBP-XE-RcDof（44-101）的雙酶切（NcoⅠ／ XhoⅠ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)6 344 bp 的載體條帶和174 bp的目的基因條帶，大小均與預(yù)期一致，見(jiàn)圖4。測(cè)序結(jié)果顯示，RcDof（44-101）基因與pETMBP-XE 載體正確連接，pETMBP-XE-RcDof（44-101）重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pETMBP-XE-RcDof（44-101）的雙酶切（NcoⅠ／ XhoⅠ）鑒定Fig.4 Restriction map of recombinant plasmid pETMBPXE-RcDof（44-101）（NcoⅠ／ XhoⅠ）

2.4 RcDof（44-101）蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定15%SDS-PAGE 分析顯示，經(jīng)IPTG 小量誘導(dǎo)后，可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約43 000 的目的蛋白條帶，見(jiàn)圖5。

圖5 RcDof（44-101）蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE profile of expressed RcDof（44-101）protein in a small quantity

2.5 RcDof（44-101）蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定15%SDS-PAGE 分析顯示，IPTG 濃度為0.1 mmol／L，溫度為37 ℃時(shí)誘導(dǎo)效果最好，目的蛋白以可溶形式存在于上清中，見(jiàn)圖6。

圖6 RcDof（44-101）蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE 分析Fig.6 SDS-PAGE profile of expressed RcDof（44-101）protein in a large quantity

2.6 純化RcDof（44-101）蛋白的鑒定

2.6.1 親和層析 15%SDS-PAGE 分析顯示，咪唑濃度為100、200、300 mmol ／ L 時(shí)，RcDof（44-101）蛋白明顯被洗脫下來(lái)，且蛋白純度與濃度較高，見(jiàn)圖7。

圖7 RcDof（44-101）蛋白親和層析產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE profile of RcDof（44-101）protein purified by affinity chromatography

2.6.2 陽(yáng)離子交換層析 親和層析純化后的蛋白經(jīng)脫鹽處理后，目的蛋白主要集中在B 液，收集B液利用陽(yáng)離子交換柱和蛋白純化儀進(jìn)一步純化，洗脫液體積為14 ～22 mL 時(shí)，A280有單一峰，RcDof（44-101）蛋白帶電狀態(tài)單一，見(jiàn)圖8。15% SDS-PAGE 分析顯示，第6 ～9 管洗脫液中蛋白濃度較高，表明陽(yáng)離子交換層析可成功純化RcDof（44-101）蛋白，見(jiàn)圖9。

圖8 RcDof（44-101）蛋白離子交換層析結(jié)果Fig.8 Purification of RcDof（44-101）protein by ion exchange chromatography

圖9 RcDof（44-101）蛋白離子交換層析產(chǎn)物的SDSPAGE 分析Fig.9 SDS-PAGE profile of RcDof（44-101）protein purified by ion exchange chromatography

2.6.3 分子篩層析 洗脫液體積為15 ～20 mL 時(shí)，A280有單一峰，對(duì)稱性好且分散度低，聚合狀態(tài)單一且為單體。15% SDS-PAGE 分析顯示，第5 ～7 管蛋白濃度較高，見(jiàn)圖10。

圖10 RcDof（44-101）蛋白分子篩層析產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.10 SDS-PAGE profile of RcDof（44-101）protein purified by molecular sieve chromatography

2.6.4 蛋白濃縮 濃縮后的蛋白濃度為10 mg／mL，可用于后續(xù)晶體生長(zhǎng)試驗(yàn)，見(jiàn)圖11。

圖11 濃縮蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.11 SDS-PAGE profile of concentrated protein

3 討 論

鋅指蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，種類較多，Dof 蛋白含有特異單鋅指DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用［21］。研究發(fā)現(xiàn)，DAG1（Dof 同源蛋白）激活后，可增強(qiáng)擬南芥光敏色素基因B（phytochrome B，phB）敏感度，該基因正調(diào)節(jié)GA合成基因AtGA3ox1 和AtGA3ox2，負(fù)調(diào)節(jié)GA 降解基因AtGA2ox2，從而影響胚軸伸長(zhǎng)，使植株產(chǎn)生矮化表型［22-23］。另外，Dof 蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)脫落酸（abscisic acid，ABA）合成、降解及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，使ABA 含量發(fā)生改變，同樣會(huì)使植物矮化［24-25］。

本實(shí)驗(yàn)室前期利用cDNA-AFLP 技術(shù)從高矮稈蓖麻中分離矮化相關(guān)差異表達(dá)基因RcDof，采用PCR 法克隆該基因，由于RcDof 基因?qū)僦参锂愒幢磉_(dá)基因，合適的表達(dá)載體能夠幫助蛋白正確折疊，從而獲得高純度可溶蛋白。本實(shí)驗(yàn)選擇pETMBP-XE原核表達(dá)載體，該載體含有T7-lac 啟動(dòng)子、麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）標(biāo)簽、多組氨酸（6 × His）標(biāo)簽等。T7-lac 啟動(dòng)子能夠與宿主菌大腸埃希菌BL21（DE3）共表達(dá)T7 溶菌酶，T7 溶菌酶可抑制T7 RNA 聚合酶的表達(dá)，從而增加大腸埃希菌BL21（DE3）在誘導(dǎo)和表達(dá)之間的滯留時(shí)間。6 ×His 標(biāo)簽?zāi)軌蛟鰪?qiáng)融合蛋白結(jié)合金屬的親和力，使目標(biāo)蛋白更易被洗脫，MBP 標(biāo)簽在蛋白表達(dá)時(shí)具有明顯的促溶效果，且在與目的蛋白連接處存在3 個(gè)丙氨酸，使目的蛋白與MBP 之間為剛性連接，若進(jìn)行晶體生長(zhǎng)試驗(yàn)，MBP 標(biāo)簽可攜帶目的蛋白，與目的蛋白結(jié)晶方向一致，能促進(jìn)目的蛋白結(jié)晶，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇pETMBP-XE 載體表達(dá)RcDof 蛋白。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)原核表達(dá)并純化獲得了RcDof可溶蛋白，為解析該蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，分析蛋白功能提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。